鎂對皮瓣缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：通過制作大鼠皮瓣缺血再灌注(ischemia-reperfusion IR)模型，應(yīng)用生物化學、免疫組化及光鏡等多種方法，觀察鎂對皮瓣缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其機制。為臨床上探索減輕皮瓣缺血再灌注損傷，提高組織瓣移植成活率，提供新思路和理論依據(jù)。 方法 1、實驗動物：雄性健康清潔級Wistar大鼠48只，稱重，編號。 2、皮瓣制備方法：2％戊巴比妥鈉(40mg/Kg)腹腔注射麻醉，每3小時追加一次(

2、20mg/Kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，于右下腹設(shè)計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。 3、實驗動物分組：將大鼠隨機分為三組：(1)對照組16只：皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理。(2)缺血再灌注組，即IR組16只：術(shù)前24小時腹腔注射0.3ml生理鹽水，皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈，皮瓣原位縫合，8小時后再次手術(shù)去除血管夾。(3)鎂-缺血再灌注，即鎂

3、-IR組16只：于術(shù)前24小時，向大鼠腹腔注射硫酸鎂0.5g/kg，其余操作同非-IR組。 4、取材：IR組和鎂-IR組的8只大鼠于掀起皮瓣后即刻、再灌注后1h、24h分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織1.0cm×0.5cm，對照組分別于掀起皮瓣即刻、術(shù)后9h和33h取材。所取組織部分用4％多聚甲醛即時固定待做石蠟切片及免疫組化染色；部分超低溫冰凍保存，行生化監(jiān)測。各組另8只大鼠于缺血再灌注后7天觀察皮瓣成活情況，并計算皮瓣成活率

4、。 5、觀測指標：(1)按試劑盒說明書步驟，測定所取皮瓣組織的丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。蛋白含量用考馬斯亮藍蛋白檢測試劑盒測定。(2)火焰原子吸收法測皮瓣組織鈣離子含量。(3)通過HE染色光鏡觀察缺血再灌注損傷后皮瓣結(jié)構(gòu)的變化。(4)圖像分析方法：對免疫組化染色切片，光鏡觀察皮瓣組織中內(nèi)皮素-1(ET-1)分布部位和著色深淺程度。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)

5、進行定量分析，每組選4張切片，每張切片選取有代表性區(qū)域，隨機取互不重疊的5個400倍視野，計數(shù)測陽性目標面密度。(5)皮瓣成活率：術(shù)后7d用硫酸紙描繪皮瓣總面積和成活面積，用稱量紙得出的重量代表面積的方法計算皮瓣成活率。 6、統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0統(tǒng)計學處理軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。對不同類型數(shù)據(jù)進行不同的統(tǒng)計學處理，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、皮瓣MDA、GSH含量、SOD活性：掀

6、起皮瓣即刻對照組、IR組和鎂-IR組皮瓣MDA、GSH、SOD水平相近，差異無顯著性(P＞0.05)。缺血再灌注后1小時、24小時，IR組MDA含量分別高于對照組69％、133.7％(P＜0.01)，SOD活性分別低于對照組.47％、52.6％(P＜0.01)；GSH含量低于對照組47.3％、48.8％(P＜0.01)；鎂-IR組皮瓣MDA含量低于IR組12.6％、28.4％(P＜0.05)，SOD活性高于IR組46.5％、62.5％(

7、P＜0.01)，GSH含量高于IR組40.4％、49.2％(P＜0.01)。 2、Ca含量測定：各組掀起皮瓣即刻Ca含量水平相近，差異無顯著性(P＞0.05)。IR組Ca含量缺血再灌注后1小時、24小時，分別高于對照組126.9％、172.7％(P＜0.01)；鎂-IR組缺血再灌注后1小時、24小時，分別低于IR組21.4％、35.8％(P＜0.05)。3、組織學觀察：缺血再灌注1小時，可見IR組大量炎性細胞浸潤、粘附于微血管內(nèi)

8、皮細胞，有大量白細胞滲出到組織間隙，伴有微血管損傷，血管的完整性破壞；膠原增粗增多；缺血再灌注24小時，可見IR組除有上述表現(xiàn)外，伴有上皮明顯增生，血管增生明顯，成纖維細胞數(shù)量增多，膠原增粗增多且排列紊亂。對照組及鎂-IR組較IR組炎性細胞數(shù)量減少，上皮增生較IR組少。4、圖象定量分析：各組于掀起皮瓣即刻ET-1表達水平相近，差異無顯著性(P＞0.05)。IR組中再灌注1小時、24小時ET-1表達量高于對照組(P＜0.01)。鎂-IR組