氧化亞鐵硫桿菌遺傳多樣性及比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、T.f菌(氧化亞鐵硫桿菌)是主要的浸礦細(xì)菌之一，為了探討T.f菌浸礦機(jī)理，提高生物浸出的效率，本文從T.f菌的遺傳多樣性及比較蛋白質(zhì)組學(xué)等方面做了系統(tǒng)的研究。 本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)7個(gè)不同來(lái)源的T.f菌菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。首先采用正交實(shí)驗(yàn)方案對(duì)影響RAPD實(shí)驗(yàn)的一些影響因素如Mg2+濃度、TAQ酶的用量等進(jìn)行了優(yōu)化，從而保證了RAPD反應(yīng)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。通過(guò)T.f菌的RAPD分子標(biāo)記的研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)源不同的

2、T.f菌菌株之間存在較大的差異性，最大的相關(guān)系數(shù)是82.93％，最小的相關(guān)系數(shù)是44.44％。對(duì)T.f菌的氧化活性的測(cè)定也發(fā)現(xiàn)不同的菌株之間存在較大的差異，其中城門山T.f菌菌株活性最強(qiáng)，作為后面的試驗(yàn)菌株。 通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)條件下的T.f菌的生長(zhǎng)曲線，揭示了分別在以單質(zhì)硫、Fe2+及磷酸鹽缺失條件下T.f菌菌株的生長(zhǎng)規(guī)律。使用pH2.0的9K基本培養(yǎng)基，在30℃條件下置培養(yǎng)箱充氣培養(yǎng)，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的活菌數(shù)。研究表明，T.f菌

3、和其它細(xì)菌培養(yǎng)相似，也有靜止期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰老期。在以Fe2+為營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)條件下，氧化亞鐵硫桿菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為培養(yǎng)的第10～32hrs，T.f菌的最高濃度可達(dá)1×107.5cells/ml，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，T.f菌復(fù)制一代所需的時(shí)間約為1.59hrs；磷酸鹽缺失條件培養(yǎng)的T.f菌的對(duì)數(shù)期為第20～60hrs間，T.f菌的最高濃度只有約為1×105.5cells/ml，T.f菌復(fù)制一代所需時(shí)間約為3.48hrs；在單質(zhì)硫上培養(yǎng)的

4、T.f菌其對(duì)數(shù)期處于第4～12days之間，菌的濃度最高可達(dá)1×107.5cells/ml，細(xì)菌復(fù)制一代所需時(shí)間約為11.91hrs。 研究了不同營(yíng)養(yǎng)源培養(yǎng)對(duì)于T.f菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)源不同，所培養(yǎng)的T.f菌浸出金屬硫化礦的活性也存在明顯差異。研究了不同濃度的甲硫氨酸、L-半胱氨酸對(duì)細(xì)菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現(xiàn)在一定的濃度下L-半胱氨酸能夠促進(jìn)T.f菌浸出金屬硫化礦；而甲硫氨酸會(huì)抑制金屬硫化礦的生物浸出。這是由于

5、L-半胱氨酸具有一個(gè)巰基基團(tuán)，能夠與金屬硫化礦發(fā)生反應(yīng)生成多硫化合物，從而促使金屬硫化礦解離。研究了金屬離子Cu2+、Cd2+等對(duì)T.f菌浸出金屬硫化礦的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種金屬離子都在不同程度上抑制了金屬硫化礦的細(xì)菌浸出；但在對(duì)野生T.f菌用不同金屬離子馴化后，發(fā)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)的金屬離子濃度下，反而會(huì)促進(jìn)金屬硫化礦的細(xì)菌浸出。這些工作為后面進(jìn)一步開展比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了思路并奠定了基礎(chǔ)。 我們對(duì)雙向電泳中的8000伏聚焦時(shí)間、干膠

6、條pH范圍的選擇、蛋白上樣量等進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)選用pH4-7范圍的干膠條在8000伏電壓下聚焦5hrs，并且上樣量＞400μg時(shí)，T.f菌的分離效果好，所分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)約為540個(gè)左右。我們也對(duì)染色的方法作了比較，發(fā)現(xiàn)“Silverblue”膠底考染的方法在上樣量為900μg時(shí)，也能取得較好的效果，而且考染對(duì)后面蛋白質(zhì)質(zhì)譜的鑒定較銀染而言有更好的兼容性。 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)磷酸鹽缺失條件培養(yǎng)的T.f菌進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研

7、究。首先，采用雙向電泳的方法分離蛋白，結(jié)合MALDI-TOF/MS(基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)對(duì)分離蛋白進(jìn)行鑒定。采用pH3-10的膠條與pH4-7的膠條分別進(jìn)行第一向等電聚焦，12.5％SDS-PAGE進(jìn)行第二向電泳，得到了分辨率和重復(fù)性較好的對(duì)照組T.f菌和磷酸鹽缺失培養(yǎng)的T.f菌總蛋白的雙向電泳圖譜，并用PDquest軟件對(duì)它們進(jìn)行了圖像分析，在銀染的雙向膠上，可分辨540±15個(gè)蛋白點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了70多個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中

8、21個(gè)在磷酸鹽缺失條件下是表達(dá)上調(diào)的，50個(gè)在磷酸鹽缺失培養(yǎng)條件下是表達(dá)下調(diào)的。從膠上切下10個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，經(jīng)胰蛋白酶酶解后，MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定結(jié)合Mascot基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，鑒定出6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)已鑒定的蛋白進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)了一些與磷酸鹽缺失相關(guān)的蛋白，這包括與細(xì)胞的氧化磷酸化相關(guān)的NADH脫氫酶，與磷酸戊糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)醛酶，以及含AP2域的轉(zhuǎn)錄因子等。針對(duì)雙向電泳難以分離低分子量的小蛋白(特別是10kD

9、a以下)的缺點(diǎn)，本論文采用三種SELDI蛋白質(zhì)芯片對(duì)T.f菌表達(dá)譜的低分子量區(qū)域進(jìn)行了初步的研究，并在6360.18～15659.51Da范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)共有13個(gè)差異表達(dá)的小蛋白。 采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)源(單質(zhì)硫和Fe2+)培養(yǎng)的T.f菌的差異表達(dá)譜進(jìn)行了研究。雙向電泳結(jié)果的分析表明約有80個(gè)差異蛋白出現(xiàn)，其中在單質(zhì)硫培養(yǎng)條件下表達(dá)上調(diào)的有45個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有36個(gè)。通過(guò)MALDI-TOF-MS和ESI-MS/MS(

10、電噴霧串連質(zhì)譜)技術(shù)共鑒定出20個(gè)蛋白，其中大小為46kDa的細(xì)胞色素C和細(xì)胞色素氧化酶Ⅱ在Fe2+的氧化中起作重要的作用；有ATP合成酶的α鏈、β鏈，有雙重ATP酶域ABC載體的ATP酶成份。另外還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的與脂肪酸代謝相關(guān)的酶：Acyl-coA脫氫酶(脂酰輔酶A脫氫酶)、Enoyl-CoA水合酶、長(zhǎng)鏈脂肪酸－輔酶A連接酶(fadD-4)等并進(jìn)行了功能上的分析。同時(shí)也采用了三種SELDI蛋白質(zhì)芯片研究不同營(yíng)養(yǎng)源培養(yǎng)的T.f菌差異表