人類皰疹病毒6型誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化及其潛伏感染機(jī)制的初步研究.pdf

1、人類皰疹病毒6型(HumanHerpesvirus，HHV-6)屬于皰疹病毒β亞科，分為HHV-6A和6B兩個(gè)亞型。HHV-6是引起嬰幼兒急疹(exanthemsubitum，ES)的病原，其感染具有廣泛的親組織和細(xì)胞嗜性，CD46是HHV-6的受體。HHV-6原發(fā)感染后在機(jī)體內(nèi)以兩種方式建立持續(xù)感染，在整個(gè)生命周期中可反復(fù)被激活。它是一種重要的免疫抑制病毒，對(duì)免疫系統(tǒng)具有廣泛的免疫抑制作用，能改變感染細(xì)胞免疫分子的表達(dá)、干擾細(xì)胞因子網(wǎng)

2、絡(luò)以及抑制免疫功能。越來(lái)越多的研究表明HHV-6感染與臨床多種疾病相關(guān)。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類功能獨(dú)特的T細(xì)胞亞群，它具有免疫低反應(yīng)性和免疫調(diào)節(jié)兩大功能。Treg細(xì)胞主要包括：天然CD4+CD25+T細(xì)胞、Tr1(Tregulatorytype1cell)細(xì)胞和Th3細(xì)胞等。天然CD4+CD25+T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟，以細(xì)胞間直接接觸、細(xì)胞因子非依賴的方式發(fā)揮免疫抑制功能；

3、Tr1以分泌高水平IL-10，低水平IFN-γ，低水平或不分泌IL-2、IL-4為特征；Th3以分泌高水平TGF-β為特征。后兩群細(xì)胞以細(xì)胞因子依賴方式發(fā)揮免疫抑制功能，激活后的抑制功能是非特異性的。 Treg細(xì)胞的研究除在自身免疫、移植免疫及腫瘤免疫方面受到關(guān)注外，在病毒免疫方面也逐漸受到重視。以往的研究發(fā)現(xiàn)某些病毒如HCV、EBV、慢性逆轉(zhuǎn)錄病毒及HIV等能誘導(dǎo)CD4+Treg細(xì)胞分化，這群細(xì)胞不僅阻止由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎性

4、病理及自身免疫病的發(fā)展，同時(shí)抑制宿主保護(hù)性免疫，引起病毒潛伏或慢性感染以及免疫抑制狀態(tài)的形成。 本課題提出如下設(shè)想：HHV-6感染可誘導(dǎo)分化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，形成和維持免疫抑制狀態(tài)，有助于HHV-6的免疫逃避，使其建立潛伏或持續(xù)慢性感染。我們的研究依據(jù)是：①HHV-6感染能抑制機(jī)體免疫功能，逃避機(jī)體免疫；②HHV-6體外感染PBMCs后可誘導(dǎo)分泌高水平的IL-10，IL-10是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能的重要介質(zhì)；③CD46是HH

5、V-6的受體，通過(guò)CD46激活的信號(hào)事件能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)r1細(xì)胞，CD46可作為T(mén)r1細(xì)胞分化和增殖的生理性刺激因素之一；④某些病毒能誘導(dǎo)CD4+Treg細(xì)胞分化，它不僅阻止由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎性病理及自身免疫病的發(fā)展，同時(shí)抑制宿主保護(hù)性免疫，引起病毒潛伏或慢性感染以及免疫抑制狀態(tài)的形成。所以HHV-6感染后引起的細(xì)胞因子水平異常，尤其是高水平的IL-10可能是Treg細(xì)胞分化的標(biāo)志。 本課題從細(xì)胞增殖水平、胞內(nèi)細(xì)胞

6、因子分泌比率及細(xì)胞因子分泌水平等方面來(lái)系統(tǒng)性地研究HHV-6潛伏感染者及未感染者的HHV-6特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時(shí)對(duì)HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞的特征、功能及細(xì)胞因子分泌水平等進(jìn)行全面研究，初步從Treg細(xì)胞的角度來(lái)探討HHV-6潛伏感染的機(jī)制；建立HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞克隆，從克隆水平上研究其表型、細(xì)胞因子分泌特點(diǎn)等，為HHV-6特異性Treg細(xì)胞的克隆、篩選及功能研究奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 一、HH

7、V-6的培養(yǎng)、鑒定及其感染JJHAN細(xì)胞裂解物的制備1.HHV-6GS株接種于PHA預(yù)刺激的人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(CBMCs)，10～12天時(shí)，鏡檢出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，以培養(yǎng)細(xì)胞的核酸為模板，通過(guò)特異性引物，套式PCR擴(kuò)增得到287bp的外引物擴(kuò)增產(chǎn)物及163bp的內(nèi)引物擴(kuò)增產(chǎn)物；內(nèi)引物擴(kuò)增產(chǎn)物不能被HindⅢ單酶切；內(nèi)外引物擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果分別與Genbank中HHV-6A相應(yīng)序列比對(duì)，同源性為100﹪。 2.在J

8、JHAN細(xì)胞系上大量擴(kuò)增HHV-6GS株，收集感染細(xì)胞，進(jìn)行反復(fù)凍融并經(jīng)紫外線滅活，獲得HHV-6GS株感染的JJHAN細(xì)胞裂解物；3H-TdR摻入法細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)并確定HHV-6感染JJHAN細(xì)胞裂解物刺激人淋巴細(xì)胞增殖的最適濃度為15μg/ml，最適時(shí)間為7天。 二、HHV-6潛伏感染者T細(xì)胞免疫及其潛伏感染機(jī)制的初探1.應(yīng)用間接免疫熒光(IIF)及套式PCR(nested-PCR)分析自愿者的HHV-6感染狀況，根據(jù)檢測(cè)

9、結(jié)果將自愿者分為HHV-6潛伏感染組和未感染組。 2.免疫微磁珠分離獲得CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞，熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)鑒定分選細(xì)胞純度均大于95﹪。 3.3H-TdR摻入法細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)HHV-6潛伏感染組和未感染組的CD4+T、CD8+T細(xì)胞及PBMCs經(jīng)HHV-6感染JJHAN細(xì)胞裂解物或抗CD3抗體刺激后的增殖水平，HHV-6潛伏感染組CD4+T細(xì)胞及PBMCs經(jīng)HHV-6裂解物刺激后的增殖水平明

10、顯低于未感染組(P=0.001；P=0.039)；CD8+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激后的增殖水平及各細(xì)胞亞群經(jīng)抗CD3抗體刺激后的增殖水平在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)果表明兩組間淋巴細(xì)胞增殖水平的差異在于對(duì)HHV-6的特異性應(yīng)答的不同，而且僅限于CD4+T細(xì)胞對(duì)HHV-6特異性應(yīng)答的差異。 4.HHV-6潛伏感染者的CD4+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激后具有抑制未感染者初始CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞增殖的功能；HHV-6潛伏

11、感染者的CD8+T細(xì)胞及HHV-6未感染者CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激后均不能抑制未感染者初始CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的增殖；結(jié)果表明HHV-6潛伏感染者的CD4+T具有抑制同種初始T細(xì)胞增殖的功能。 5.FACS分析HHV-6潛伏感染者和未感染者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例，結(jié)果分別為7.25﹪±1.08﹪、7.74﹪±1.54﹪[mean±SEM]，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；半定量RT-PC

12、R檢測(cè)兩組CD4+T細(xì)胞上Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)果提示兩組CD4+T細(xì)胞對(duì)HHV-6的特異性應(yīng)答的差異并不歸因于CD4+CD25+Treg細(xì)胞。 6.Transwell共培養(yǎng)體系結(jié)果顯示，HHV-6潛伏感染者的CD4+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激后，無(wú)論在共培養(yǎng)體系還是在Transwell培養(yǎng)體系中，均能抑制同種初始CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明HHV-6潛伏感染者的CD4+T細(xì)胞經(jīng)

13、HHV-6裂解物刺激后發(fā)揮抑制功能不需要細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸，而是通過(guò)某抑制性細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮作用。 7.FACS分析兩組HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IL-10分泌比率，潛伏感染組顯著高于未感染組(P=0.004)；HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IL-4分泌比率在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ELISA檢測(cè)兩組CD4+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激分泌IL-10及IL-4的水平，潛伏感染組的IL-10分泌水平顯著高于未感染組(P

14、=0.001)；兩組IL-4分泌水平均很低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抗IL-10抗體阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2μg/ml的抗IL-10抗體即能逆轉(zhuǎn)HHV-6潛伏感染者CD4+T細(xì)胞的抑制功能(P=0.001)。結(jié)果提示HHV-6潛伏感染者的CD4+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激后的抑制功能可能與HHV-6特異性IL-10產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞有關(guān)，IL-10可能是其發(fā)揮抑制活動(dòng)的重要介質(zhì)。 8.FACS分析兩組HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞及CD8

15、+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ的分泌比率，其中潛伏感染組HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ分泌比率明顯低于未感染組(P=0.001)；HHV-6特異性CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ分泌比率在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ELISA檢測(cè)兩組CD4+T細(xì)胞經(jīng)HHV-6裂解物刺激分泌IFN-γ的水平，潛伏感染組明顯低于未感染組(P=0.028)。結(jié)果表明HHV-6潛伏感染者的CD4+Th1應(yīng)答呈選擇性減弱。 三、HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞克

16、隆的建立及其功能的初步研究1.采用重復(fù)刺激技術(shù)獲得活化的HHV-6特異性T細(xì)胞系，3H-TdR摻入法細(xì)胞增殖試驗(yàn)篩選獲得五株HHV-6特異性T細(xì)胞系；FACS分析五株HHV-6特異性T細(xì)胞系表面標(biāo)志，結(jié)果為CD4+T細(xì)胞(57.2﹪±5.84﹪；mean±SD)和CD8+T細(xì)胞(42.8﹪±6.12﹪；mean±SD)均存在于T細(xì)胞系中。 2.免疫微磁珠分離CD4+T細(xì)胞，HHV-6感染細(xì)胞裂解物重復(fù)刺激，3H-TdR摻入法細(xì)胞

17、增殖試驗(yàn)篩選獲得五株HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞系；ELISA檢測(cè)HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞系經(jīng)HHV-6裂解物刺激分泌IL-10、IFN-γ及IL-4的水平，結(jié)果顯示HHV-6特異性W-CD4+T細(xì)胞系的細(xì)胞因子分泌特征偏向Tr1細(xì)胞。 3.液體微孔有限稀釋技術(shù)克隆HHV-6特異性CD4+T細(xì)胞克隆，獲得的5株CD4+T細(xì)胞克隆中有4株對(duì)HHV-6裂解物的刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈而特異的增殖應(yīng)答，并且其增殖應(yīng)答水平與HHV-6裂解物