一個水稻莖葉優(yōu)勢表達鋅指基因啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、基因表達與否以及表達時間、表達部位需要啟動子的順式作用元件與相應的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用。根據(jù)需要選擇或人工構(gòu)建合適的啟動子(組成型、組織器官特異性、誘導型或復合型啟動子)，可以研究新基因的功能，闡明植物的生長、發(fā)育、分化及繁殖過程與機理，還可以在植物特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)對外源基因表達的定時、定點、定量的精確調(diào)控。水稻莖葉特異性啟動子是只在水稻莖和葉等營養(yǎng)器官中表達，而不在生殖器官和種子食用部位表達的特殊啟動

2、子，對這類啟動子的研究和應用，不僅有助于闡釋相關(guān)基因的生物學功能，而且在基因工程中使用此類啟動子將有助于消除人們對轉(zhuǎn)基因水稻食品安全性的擔心。 本實驗室利用RT-PCR技術(shù)分析了354個水稻鋅指基因在水稻授粉受精后的根、莖、葉及種子不同發(fā)育階段的表達情況，獲得了170個水稻鋅指基因的表達特征，鑒定出一批可能在水稻不同器官或種子不同發(fā)育階段特異性表達的鋅指基因。本研究選擇了1個水稻鋅指基因ZF153開展研究。其主要結(jié)果如下：

3、 1、利用RT-PCR技術(shù)分析ZF153鋅指基因在水稻不同發(fā)育時期、不同器官的表達特征。研究結(jié)果表明，ZF153基因只在水稻的莖、葉中表達，在根、花及種子發(fā)育的前期、中期、后期都沒有表達。該結(jié)果暗示ZF153基因是一個在莖葉中特異表達的鋅指基因。 2、利用PCR擴增了ZF153鋅指基因及其上游啟動子區(qū)域，并分別克隆于T載體及pBlueks，測序后在NCBI上進行序列比對的結(jié)果表明，我們克隆的ZF153鋅指基因及其上游啟動子區(qū)域

4、的序列完全正確。應用PLACE預測分析了ZF153鋅指基因上游啟動子區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)其中含有大多數(shù)高等植物啟動子的保守元件，說明它具有潛在的啟動子活性；同時，其中具有多個特異性調(diào)控元件，如YACT一葉肉細胞特異表達的順式元件，暗示出該序列對基因的表達調(diào)控具有一定的特異性。 3、分別構(gòu)建了鋅指基因ZF153啟動子與GUS的融合表達載體pC153P-GUS及ZF153的cDNA正義和反義表達載體pCA153gS和pCA153gA。通過

5、農(nóng)桿菌介導法，已經(jīng)獲得了pC153P-GUS和部分pCA153gS的再生植株。pC153P-GUS轉(zhuǎn)基因T<,0>代植株GUS活性分析顯示：在pC153P-GUS轉(zhuǎn)基因T<,0>代植株的根、莖、葉、穎殼中檢測到GUS活性，其中莖和葉中GUS活性表現(xiàn)較強，而根和穎殼中表現(xiàn)較弱，在雄蕊和雌蕊及種子不同發(fā)育階段中沒有檢測到GUS活性，表明ZF153啟動子可能是一個水稻非生殖器官表達，且在莖、葉中優(yōu)勢表達啟動子。研究結(jié)果暗示了ZF153基因可能