PPO基因沉默對(duì)人惡性黑素瘤細(xì)胞A375增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一類起源于神經(jīng)嵴的黑素細(xì)胞惡性腫瘤,發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的第三位(6.8％~20％)[1],是皮膚科領(lǐng)域最常引起死亡的惡性腫瘤。惡性黑色素瘤的惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早,預(yù)后嚴(yán)重,治療的關(guān)鍵是早期診斷、正確分期;對(duì)于早期非侵襲性的病變,手術(shù)徹底清除病變?yōu)樽罴阎委熯x擇;對(duì)于晚期患者,主要治療為化療及免疫治療等?；熕幬锟蓡斡没蚵?lián)合應(yīng)用[2],但目前的治療方法仍不理想,且免疫療法

2、仍處在試驗(yàn)階段。
　　 PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)基因是劉思源[3]等利用克隆篩選技術(shù)找到的一個(gè)新的癌基因,該基因位于1p36區(qū),編號(hào)為KIAA0090,DNA長(zhǎng)度約36000bp,eDNA長(zhǎng)度6022bp。共有25個(gè)外顯子,編碼993個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)該基因在多種惡性腫瘤癌組織中都有高表達(dá),與細(xì)胞增殖和磷酸化關(guān)系密切,能夠使MAPK.通路中的MEK1/2和ER

3、K2磷酸化,因此把該基因命名為PPO(poroliferation andphosphorylation oncogene)。
　　 RNA干擾技術(shù)是今年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法。RNA干擾(RNA.interference RNAi)是一種由雙鏈RNA(double-standedRNA,dsRNA)誘發(fā)的基因沉默(gene sileneing)。RNA干擾技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法。某些惡性黑色素

4、瘤演變后,對(duì)化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、抑制癌基因的表達(dá)產(chǎn)生抵抗。RNA干擾技術(shù)為治療對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性的惡性黑色素瘤開辟了新的途徑。
　　 劉亞玲[4]等利用PPO基因的cDNA序列片段,免疫雌性BALB/c小鼠。取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),利用骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合后,尋找雜交瘤抗體進(jìn)行克隆化。單克隆抗體用免疫擴(kuò)散的方法行Ig亞類測(cè)定?？寺』碾s交瘤細(xì)胞給小鼠腹腔注射,抽取腹水后使抗體純化,制作完成了PPO抗體。并用免疫印跡法檢測(cè)PPO

5、基因在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)情況,以及檢測(cè)PPO抗體。結(jié)果顯示,PPO蛋白印跡位于140×103附近,膜上無其他蛋白印跡,蛋白印跡清晰,表明PPO抗體具有很強(qiáng)的特異性,可以作為檢測(cè)惡性腫瘤的一種特異性抗體此前該課題組已經(jīng)進(jìn)行了PPO基因在A375細(xì)胞中的表達(dá)研究,發(fā)現(xiàn)PPO基因在細(xì)胞水平同樣存在過表達(dá)[5],但能否通過RNAi的方法沉默PPO基因及其表達(dá),抑制MAPK通路中PPO基因相關(guān)蛋白的表達(dá),從而在細(xì)胞水平抑制惡性黑色素瘤的生長(zhǎng)增

6、殖,有待進(jìn)一步研究.
　　 方法:
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml,含鏈霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2倒置相差顯微鏡觀察A375細(xì)胞細(xì)胞分化及形態(tài)。
　　 3熒光顯微鏡下觀察不同MOI(病毒個(gè)數(shù)/細(xì)胞個(gè)數(shù))=5,10,20,50,100時(shí),腺病毒轉(zhuǎn)染A375

7、細(xì)胞的效率及細(xì)胞分化、形態(tài)變化。
　　 4取轉(zhuǎn)染后48小時(shí)細(xì)胞做RT-PCR,觀察A375細(xì)胞PPO的表達(dá)變化。
　　 5 MTT比色分析法檢測(cè)MOI=50時(shí),在轉(zhuǎn)染后第1天、第3天、第5天、第7天對(duì)A375細(xì)胞增殖抑制的影響。
　　 6采用流式細(xì)胞分析術(shù),Anexin-v-PI雙染色檢測(cè)MOI=50時(shí),在轉(zhuǎn)染后第1天、第3天、第5天、第7天A375細(xì)胞早期凋亡的變化,將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(不加任何藥物),空轉(zhuǎn)錄

8、病毒組(加入HK),實(shí)驗(yàn)組(加入同等量PPO)
　　 7運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用單因素方差分析,以a=0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1未經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染處理過的人A375細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長(zhǎng),分布均勻,大小基本一致,增殖旺盛,核固縮現(xiàn)象少見。
　　 2轉(zhuǎn)染24小時(shí)后MOI=5,10,20,50,100時(shí)轉(zhuǎn)染效率分別為50％、67％,69％、70％、70％。

9、MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最大且增大MOI值轉(zhuǎn)染效率不再變化,故以下轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)取MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞的影響。A375出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,有的細(xì)胞變狹長(zhǎng)兩端出現(xiàn)偽足,漂浮細(xì)胞增多,隨時(shí)間延長(zhǎng),上述現(xiàn)象更加明顯,而陰性對(duì)照組、空轉(zhuǎn)錄病毒組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,分布均勻,大小一致,僅有少數(shù)脫壁細(xì)胞。
　　 3轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞48小時(shí)后,用RT-PCR方法檢測(cè)PPO基因mRNA表達(dá),實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組,空轉(zhuǎn)錄

10、病毒組的mRNA表達(dá)強(qiáng)度減低,證明腺病毒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞并部分沉默PPO基因。
　　 4 MTT比色分析法檢測(cè)處理因素對(duì)人A375細(xì)胞增殖的影響。
　　 轉(zhuǎn)染后第1天,第2天及第3天,陰性對(duì)照組,空轉(zhuǎn)錄病毒組,實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異(p＞0.05)。轉(zhuǎn)染后第5天,第7天陰性對(duì)照組與空轉(zhuǎn)錄病毒見無顯著性差異(p＞0.05),實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與空轉(zhuǎn)錄病毒組見均有顯著性差異(p＜0.05)。5流式細(xì)胞儀,Ane

11、xin-v-PI雙染色檢測(cè)MOI=50轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間各組對(duì)
　　 A375細(xì)胞早期凋亡率的變化與對(duì)照組有顯著性差異(p＜0.05)
　　 結(jié)論:
　　 1 PPO腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染人A375惡性黑色素瘤細(xì)胞。
　　 2經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染后,能下調(diào)人.A375惡性黑色素瘤細(xì)胞PPO基因mRNA的表達(dá)。
　　 3下調(diào)對(duì)PPO基因的表達(dá)對(duì)A375細(xì)胞生長(zhǎng)有增殖抑制作用。
　　 4 PPO腺病毒載體轉(zhuǎn)染