PPO基因沉默對人惡性黑素瘤細胞A375增殖影響的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一類起源于神經嵴的黑素細胞惡性腫瘤,發(fā)病率占皮膚惡性腫瘤的第三位(6.8%~20%)[1],是皮膚科領域最常引起死亡的惡性腫瘤。惡性黑色素瘤的惡性程度高、發(fā)生轉移早,預后嚴重,治療的關鍵是早期診斷、正確分期;對于早期非侵襲性的病變,手術徹底清除病變?yōu)樽罴阎委熯x擇;對于晚期患者,主要治療為化療及免疫治療等?;熕幬锟蓡斡没蚵?lián)合應用[2],但目前的治療方法仍不理想,且免疫療法

2、仍處在試驗階段。
   PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)基因是劉思源[3]等利用克隆篩選技術找到的一個新的癌基因,該基因位于1p36區(qū),編號為KIAA0090,DNA長度約36000bp,eDNA長度6022bp。共有25個外顯子,編碼993個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)該基因在多種惡性腫瘤癌組織中都有高表達,與細胞增殖和磷酸化關系密切,能夠使MAPK.通路中的MEK1/2和ER

3、K2磷酸化,因此把該基因命名為PPO(poroliferation andphosphorylation oncogene)。
   RNA干擾技術是今年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法。RNA干擾(RNA.interference RNAi)是一種由雙鏈RNA(double-standedRNA,dsRNA)誘發(fā)的基因沉默(gene sileneing)。RNA干擾技術是近年來發(fā)現(xiàn)的從基因水平治療腫瘤的新方法。某些惡性黑色素

4、瘤演變后,對化療誘導的細胞凋亡、抑制癌基因的表達產生抵抗。RNA干擾技術為治療對化療產生耐藥性的惡性黑色素瘤開辟了新的途徑。
   劉亞玲[4]等利用PPO基因的cDNA序列片段,免疫雌性BALB/c小鼠。取小鼠脾細胞進行體外培養(yǎng),利用骨髓瘤細胞與脾細胞融合后,尋找雜交瘤抗體進行克隆化。單克隆抗體用免疫擴散的方法行Ig亞類測定??寺』碾s交瘤細胞給小鼠腹腔注射,抽取腹水后使抗體純化,制作完成了PPO抗體。并用免疫印跡法檢測PPO

5、基因在惡性黑色素瘤組織中表達情況,以及檢測PPO抗體。結果顯示,PPO蛋白印跡位于140×103附近,膜上無其他蛋白印跡,蛋白印跡清晰,表明PPO抗體具有很強的特異性,可以作為檢測惡性腫瘤的一種特異性抗體此前該課題組已經進行了PPO基因在A375細胞中的表達研究,發(fā)現(xiàn)PPO基因在細胞水平同樣存在過表達[5],但能否通過RNAi的方法沉默PPO基因及其表達,抑制MAPK通路中PPO基因相關蛋白的表達,從而在細胞水平抑制惡性黑色素瘤的生長增

6、殖,有待進一步研究.
   方法:
   1細胞培養(yǎng)
   將A375細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml,含鏈霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內常規(guī)傳代培養(yǎng)。
   2倒置相差顯微鏡觀察A375細胞細胞分化及形態(tài)。
   3熒光顯微鏡下觀察不同MOI(病毒個數(shù)/細胞個數(shù))=5,10,20,50,100時,腺病毒轉染A375

7、細胞的效率及細胞分化、形態(tài)變化。
   4取轉染后48小時細胞做RT-PCR,觀察A375細胞PPO的表達變化。
   5 MTT比色分析法檢測MOI=50時,在轉染后第1天、第3天、第5天、第7天對A375細胞增殖抑制的影響。
   6采用流式細胞分析術,Anexin-v-PI雙染色檢測MOI=50時,在轉染后第1天、第3天、第5天、第7天A375細胞早期凋亡的變化,將實驗分為陰性對照組(不加任何藥物),空轉錄

8、病毒組(加入HK),實驗組(加入同等量PPO)
   7運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,采用單因素方差分析,以a=0.05為顯著性差異標準。
   結果:
   1未經腺病毒轉染處理過的人A375細胞呈梭形或多角形,貼壁生長,分布均勻,大小基本一致,增殖旺盛,核固縮現(xiàn)象少見。
   2轉染24小時后MOI=5,10,20,50,100時轉染效率分別為50%、67%,69%、70%、70%。

9、MOI=50時轉染效率達到最大且增大MOI值轉染效率不再變化,故以下轉染實驗取MOI=50時轉染后不同時間對細胞的影響。A375出現(xiàn)不同程度的皺縮、破裂,細胞生長狀態(tài)不佳,有的細胞變狹長兩端出現(xiàn)偽足,漂浮細胞增多,隨時間延長,上述現(xiàn)象更加明顯,而陰性對照組、空轉錄病毒組細胞生長旺盛,分布均勻,大小一致,僅有少數(shù)脫壁細胞。
   3轉染A375細胞48小時后,用RT-PCR方法檢測PPO基因mRNA表達,實驗組較陰性對照組,空轉錄

10、病毒組的mRNA表達強度減低,證明腺病毒已經成功轉染A375細胞并部分沉默PPO基因。
   4 MTT比色分析法檢測處理因素對人A375細胞增殖的影響。
   轉染后第1天,第2天及第3天,陰性對照組,空轉錄病毒組,實驗組間無顯著性差異(p>0.05)。轉染后第5天,第7天陰性對照組與空轉錄病毒見無顯著性差異(p>0.05),實驗組與陰性對照組,實驗組與空轉錄病毒組見均有顯著性差異(p<0.05)。5流式細胞儀,Ane

11、xin-v-PI雙染色檢測MOI=50轉染后不同時間各組對
   A375細胞早期凋亡率的變化與對照組有顯著性差異(p<0.05)
   結論:
   1 PPO腺病毒載體成功轉染人A375惡性黑色素瘤細胞。
   2經腺病毒轉染后,能下調人.A375惡性黑色素瘤細胞PPO基因mRNA的表達。
   3下調對PPO基因的表達對A375細胞生長有增殖抑制作用。
   4 PPO腺病毒載體轉染

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