RNAi沉默WT1基因逆轉惡性黑素瘤細胞耐藥性的研究.pdf

1、目的：惡性黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，其對常規(guī)化療藥物的耐藥性嚴重影響其預后，因而逆轉腫瘤細胞的耐藥性，以提高化療療效，是治療惡性黑素瘤的重要課題。目前認為惡性黑素瘤耐藥的主要機制是凋亡抑制，越來越多研究證實特異性下調某些凋亡抑制基因以促進腫瘤細胞凋亡，可以增加惡性黑素瘤對化療藥物的敏感性。WT1基因最早發(fā)現(xiàn)作為一種抑癌基因參與Wilm's瘤的發(fā)生，近年來研究證實WT1基因在多種實體瘤細胞中高表達，具有抑制腫瘤細胞凋亡作用，發(fā)揮癌基

2、因的作用。國外研究發(fā)現(xiàn)WT1基因在80%以上惡性黑素瘤中表達，而在良性色素痣和正常皮膚中未見表達，下調WT1基因可以抑制惡性黑素瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。但抑制WT1基因表達能否逆轉惡性黑素瘤細胞的耐藥性尚未見報道。RNA干擾技術是近年來發(fā)展起來的基因沉默新技術，能高效，特異地抑制目的基因的表達，因此很快成為研究基因功能的重要工具。本研究旨在探討利用RNA干擾沉默WT1基因對人轉移性惡性黑素瘤WM451細胞生長，凋亡及其對順鉑敏感性的影

3、響，為惡性黑素瘤的基因治療提供理論依據。 方法： 1．構建針對WT1基因的siRNA真核表達載體； 2．利用脂質體將siRNA真核表達載體轉入惡性黑素瘤WM451細胞中，并檢測轉染效率； 3．利用RT-PCR、Western-Blot及免疫細胞化學染色方法檢測WM451細胞中WT1基因mRNA及蛋白水平的表達，測定基因沉默效果； 4．用MTT法測定WM451細胞生長曲線； 5．電鏡下觀察細

4、胞凋亡形態(tài)； 6．用MTT法檢測WM451細胞對化療藥物的敏感性。 結果： 1．成功構建靶向WT1基因的siRNA真核表達載體； 2．RT-PCR檢測顯示WT1基因在惡性黑素瘤WM451細胞中高表達； 3．利用脂質體為載體將siRNA真核表達載體轉染WM451細胞，轉染率為73%，轉染后細胞中WT1mRNA表達水平下降67%，蛋白表達水平下降67%； 4．RNA干擾沉默WT1基因可抑制細胞

5、增殖，促進細胞凋亡； 5．電鏡下可以看到凋亡細胞微絨毛減少，細胞核固縮，染色體邊集； 6．siRNA實驗組細胞IC50從9．37ug/ml降至4．13ug/ml，逆轉倍數(shù)2．29，siRNA實驗組WM451細胞對順鉑的敏感性增加。 結論： 1．靶向WT1的序列特異性siRNA可顯著抑制WT1基因的表達； 2．下調WM451細胞WT1基因表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡； 3．RNA干擾靶向