小干擾RNA對(duì)惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中HOXB7基因的干涉作用.pdf

1、背景惡性黑色素瘤(melanoma)是一種惡性程度高、生存率低、預(yù)后極差的腫瘤。從細(xì)胞生物學(xué)的角度來看，影響其預(yù)后的因素主要有兩點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)和腫瘤新生血管的生成程度。HOXB7基因?qū)儆谕春谢?，是位?7號(hào)染色體上的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，有著在進(jìn)化上高度保守的DNA序列，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等過程中起重要作用。有研究報(bào)道：HOXB7基因在惡性黑色素瘤細(xì)胞株中普遍高表達(dá)，可特異性誘導(dǎo)bFGF、VEGF、GROa等血管生成因子及腫瘤

2、生長因子的表達(dá)水平上調(diào)，從而促使腫瘤新生血管形成，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步增殖與轉(zhuǎn)移，是惡性黑色素瘤基因治療中一個(gè)非常重要的靶點(diǎn)。 RNA干擾(RNAi)指通過小分子干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后同源靶基因沉默現(xiàn)象，它可以通過降解靶基因mRNA序列來達(dá)到封閉基因表達(dá)的效果，目前RNA干擾已成為基因功能分析及治療中不可缺少的一種重要技術(shù)手段。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)HOXB7基因序列設(shè)計(jì)并合成3條siRNA序列，研究其抑制A375

3、細(xì)胞株中HOXB7基因后對(duì)相應(yīng)血管生成因子bFGF基因的表達(dá)下調(diào)水平，以及腫瘤細(xì)胞生長受抑制程度；并探討HOXB7基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)惡性黑色素瘤的腫瘤生長及瘤內(nèi)微血管生成的影響。初步探索siRNA干擾HOXB7基因表達(dá)后對(duì)于惡性黑色素瘤臨床治療上的應(yīng)用價(jià)值。 方法根據(jù)HOXB7基因mRNA序列設(shè)計(jì)出三條siRNA序列，采用化學(xué)合成法合成。利用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，將三條siRNA分別導(dǎo)入到人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞中。

4、RT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HOXB7及bFGF的mRNA水平，F(xiàn)CM檢測(cè)48小時(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中bFGF蛋白表達(dá)情況，MTT法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞增殖情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇一條有效的siRNA序列，構(gòu)建siRNA體內(nèi)表達(dá)載體。建立惡性黑色素瘤動(dòng)物模型，將表達(dá)siRNA的質(zhì)粒進(jìn)行瘤內(nèi)注射，觀察其對(duì)腫瘤生長及腫瘤內(nèi)血管生成的影響。 結(jié)果siRNA轉(zhuǎn)染惡性黑色素瘤A375細(xì)胞24h及48h后，運(yùn)用

5、半定量RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)HOXB7基因及其誘導(dǎo)的血管生長因子bFGF基因mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HOXB7基因表達(dá)受抑制后，其誘導(dǎo)的bFGF基因表達(dá)水平亦明顯下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)HOXB7基因誘導(dǎo)的血管生成因子bFGF蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞增殖情況亦較對(duì)照組明顯受到抑制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示HOXB7siRNA質(zhì)粒注射組的裸鼠腫瘤體積明顯小

6、于陰性質(zhì)粒注射組與生理鹽水對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第八因子相關(guān)抗原免疫組化病理切片染色也觀察到HOXB7siRNA質(zhì)粒注射組瘤內(nèi)微血管密度顯著減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論靶向HOXB7基因的siRNA轉(zhuǎn)染惡性黑色素瘤A375細(xì)胞后，可以分別在mRNA水平及蛋白水平有效沉默HOXB7基因及其調(diào)控的血管生成因子bFGF的表達(dá)，對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長、增殖亦起到一定的抑制效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明針對(duì)HOXB7基因的siRNA表達(dá)載體可有效