基于CIA大鼠兩種抗原短肽特異性自身免疫反應的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種典型的由抗原驅動和T細胞介導的慢性、進行性的自身免疫性疾病。其特征是外周循環(huán)中可檢出大量的針對自身抗原成分的自身抗體和抗原特異性T、B淋巴細胞。該病病因復雜,發(fā)病機制尚不明確。目前尚缺乏有效的早期診斷指標。該病病變主要累及外周小關節(jié),最終可能會導致進行性關節(jié)破壞、畸形,甚至功能喪失。膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthr

2、itis,CIA)模型是通過用Ⅱ型膠原(typeⅡ collagen,CⅡ)免疫鼠類誘導的多關節(jié)炎癥。由于其引起的癥狀和關節(jié)病理與RA有諸多相似之處而被認為是人類RA的獨特動物模型,被較廣泛地用于RA機制的研究。
　　 目的:
　　 建立新的血清學實驗診斷體系,尋找新的自身抗體標志物,觀察環(huán)瓜氨酸肽(CCP)及Ⅱ型膠原短肽(CⅡ260-272)作為特異性抗原刺激物對膠原誘導型關節(jié)炎(CIA)大鼠淋巴細胞激活的影響,以及經(jīng)

3、上述特異性抗原刺激后細胞上清中IFN-γ等細胞因子的分泌情況,探討上述抗原在CIA大鼠成模過程中的作用,并為進一步了解其在RA中的作用機制提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 建立CIA大鼠模型,采用肽酰精氨酸脫亞氨基酶(PAD)對牛Ⅱ型膠原(bCⅡ)進行瓜氨酸化(citrullination),同時選擇CⅡ短肽(CⅡ260-272)和環(huán)瓜氨酸肽(CCP)及PAD酶為包被抗原,建立檢測其血清中自身抗體的酶聯(lián)免疫吸附試

4、驗(ELISA)。分別在建模1周、2周…8周后分離、培養(yǎng)大鼠脾淋巴細胞,采用CCK-8法檢測CCP及Ⅱ型膠原短肽(CⅡ260-272)對淋巴細胞增殖反應的影響,并用ELISA法檢測經(jīng)上述特異性抗原刺激后細胞上清中IFN-γ、IL-4、IL-17等細胞因子的分泌情況,同時對建模時間、細胞增殖指數(shù)及其他血清學指標、關節(jié)炎癥指數(shù)等的關系進行相關分析。
　　 結果:
　　 1、造模后第10d,模型組大鼠即出現(xiàn)腫脹高峰,隨著時間的

5、延長,關節(jié)炎癥指數(shù)繼續(xù)升高,至16d時出現(xiàn)第2個關節(jié)炎癥高峰。同時模型組大鼠在首次免疫第2w即出現(xiàn)滑膜炎癥和血管翳高峰,盡管到后期有所減退,至實驗結束時(8w后)仍可觀察到較弱的關節(jié)滑膜炎癥和血管翳形成。病理學觀察結果顯示,模型組大鼠關節(jié)囊滑膜組織呈乳頭狀突起增生,滑膜層變厚,排列紊亂,滑膜內(nèi)可見淋巴細胞、漿細胞,以及巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤,血管翳明顯增多。與0周組相比,模型組大鼠寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)表達水平均有不同程度

6、的升高,有顯著統(tǒng)計學差異(P均<0.01)。相關性分析表明CIA模型組大鼠血清中COMP表達水平與關節(jié)炎癥指數(shù)(P<0.05)呈顯著正相關。
　　 2、血清學指標檢測結果顯示,模型組大鼠中,抗PAD酶抗體、抗CCP抗體、抗CⅡ短肽抗體及抗CⅡ抗體、抗Cit-CⅡ抗體均出現(xiàn)不同程度的升高,其中尤以抗CⅡ短肽抗體與抗CCP抗體升高更為明顯。相關性分析結果表明,前者與關節(jié)炎癥、滑膜炎、血管翳顯著相關(P<0.05或P<0.01)。同時

7、,抗PAD酶抗體與抗CCP抗體、抗CⅡ短肽抗體及抗Cit-CⅡ抗體水平(P均<0.01),抗CCP抗體與抗CⅡ短肽抗體、抗CⅡ及抗Cit-CⅡ抗體(P<0.05或P<0.01)也存在顯著相關關系。
　　 3、增殖檢測結果顯示CCP抗原特異性T細胞(CCP-AST)細胞及CⅡ短肽抗原特異的T細胞(CⅡ-AST)在首次免疫2～3周即出現(xiàn)明顯的增殖反應,顯著高于實驗對照(FLAK肽刺激組)和細胞對照組(0周CCP刺激組)的增殖水平(P

8、<0.01或P<0.05)。相關分析結果表明基于CCP刺激的特異性T細胞增殖刺激指數(shù)與CIA病程(建模時間)、關節(jié)炎癥指數(shù)及抗CCP抗體、抗CⅡ短肽抗體產(chǎn)生水平顯著相關(P<0.01或P<0.05),但未見CⅡ短肽抗原特異性T細胞增殖反應與抗CⅡ短肽抗體有相關關系(P>0.05)。
　　 4、細胞因子檢測結果顯示,與對照組相比,早期模型組大鼠血清中IFN-γ、IL-17的分泌水平顯著升高(P均<0.01),而IL-4一直保持較低

9、水平。4周開始,IFN-γ水平開始顯著下降(P均<0.01)。在兩種抗原肽刺激后的細胞培養(yǎng)上清中,IFN-γ和IL-17的檢出水平與0周對照組比較,均有顯著提高(P均<0.01),與血清中檢測結果不同的是,IL-4濃度幾乎一直保持較高水平。相關性分析結果表明,經(jīng)CCP刺激后RSMC分泌產(chǎn)生的IFN-γ、IL-17水平與CCP-AST細胞增殖呈顯著正相關性(P均<0.01),并與CⅡ短肽抗原特異性T細胞增殖亦互為相關關系；IL-4的產(chǎn)生水

10、平與CCP-AST細胞增殖亦有相關關系(P<0.05),但與CⅡ短肽特異性T細胞增殖未見相關性。
　　 結論:
　　 成功建立CIA大鼠模型,并對其應用實施效果進行了評價。在CIA大鼠成模過程中,廣泛存在著特異性體液免疫和細胞免疫功能異常。除檢出抗CⅡ有關的抗體外,還可檢出抗PAD酶與抗CCP抗體。CCP及CⅡ260-272短肽抗原可刺激CIA大鼠脾淋巴細胞的體外異常增殖,此種增殖作用在建模早期即可出現(xiàn),而且上述抗原可在