胃癌MDR細(xì)胞特異性結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽的篩選.pdf

1、本文研究目的：利用噬菌體呈現(xiàn)肽庫技術(shù)，以胃癌藥敏細(xì)胞及正常胃粘膜上皮永生化細(xì)胞為陰性細(xì)胞，采用消減篩選結(jié)合MTT藥物敏感試驗(yàn)的方法，篩選能夠特異性結(jié)合并逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞MDR表型的短肽。 研究方法： (1)利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，以正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES及胃癌藥敏細(xì)胞SGC7901為陰性吸附細(xì)胞，胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR為篩選靶細(xì)胞，進(jìn)行全細(xì)胞消減篩選。 (2)篩選4輪后，

2、隨機(jī)挑取200個(gè)噬茵體克隆，利用單劑量化療藥物MTT體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)初步篩選出能夠降低胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性的噬菌體克隆。 (3)篩選出的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，并進(jìn)行短肽序列的同源性分析。 (4)根據(jù)序列分析的結(jié)果，選擇重復(fù)次數(shù)多或有同源序列的噬菌體克隆，以ELISA法及結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定噬菌體與胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR的結(jié)合活性，排除假陽性或無差異結(jié)合的噬菌體。 (5)免疫細(xì)胞熒光染色

3、鑒定噬菌體與胃癌多藥耐藥細(xì)胞結(jié)合的特異性。 (6)人工合成陽性噬菌體呈現(xiàn)短肽，采用細(xì)胞結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)ELISA驗(yàn)證合成肽對(duì)噬菌體與靶細(xì)胞結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。 (7)利用熒光標(biāo)記的合成肽，以正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES、多種胃癌藥敏細(xì)胞、3T3細(xì)胞為陰性對(duì)照，觀察陽性多肽與胃癌耐藥細(xì)胞結(jié)合的特異性。 (8)激光聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)多肽結(jié)合的細(xì)胞部位。 (9)能夠特異性結(jié)合胃癌耐藥的陽性噬菌體克隆，利用M

4、TT篩選能高效逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細(xì)胞MDR表型的克隆。 (10)篩選到的噬菌體克隆，合成短肽，利用MTT實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀，初步探討其對(duì)胃癌多藥耐藥細(xì)胞MDR表型逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。 (11)荷瘤裸鼠多肽體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)；荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感實(shí)驗(yàn)。 研究結(jié)果： (1)在4輪的篩選中，每輪均加入2×1011PFU的噬菌體，并滴定每輪洗脫液中的噬菌體數(shù)量，計(jì)算噬菌體的產(chǎn)率，噬菌體在靶細(xì)胞SGC7901/ADR或SGC7901

5、/VCR上出現(xiàn)顯著富集，而對(duì)照細(xì)胞SGC7901、GES則保持低水平的結(jié)合或有不同程度的減少。 (2)隨機(jī)挑選200個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行單劑量化療藥物MTT體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)初步篩選，與無關(guān)噬菌體及單用化療藥物相比發(fā)現(xiàn)其中161個(gè)克隆能夠提高化療藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。 (3)將這161個(gè)克隆測(cè)序，最終產(chǎn)生50個(gè)序列，經(jīng)BLAST分析，數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與這些短肽序列完全一致的蛋白質(zhì)分子，與部分蛋白質(zhì)有較高的同源性。 (4

6、)根據(jù)測(cè)序及生物信息學(xué)分析的結(jié)果，選取24個(gè)克隆進(jìn)行ELISA法及結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23這5個(gè)噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明顯的差異性結(jié)合；GMBP42,GMBP46這2個(gè)噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明顯的差異性結(jié)合。其中GMBP1噬菌體克隆與SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的結(jié)合能力均明顯高于SGC7901。

7、 (5)免疫細(xì)胞熒光染色顯示，GMBP1噬菌體在SGC7901/VCR和SGC7901/ADR上的結(jié)合明顯高于對(duì)照細(xì)胞SGC7901及GES。 (6)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)ELISA顯示，GMBP1噬菌體與SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的結(jié)合及內(nèi)化能被其所呈現(xiàn)插入序列的人工合成肽GMBP1競(jìng)爭(zhēng)抑制。 (7)熒光顯微鏡顯示，標(biāo)記的多肽FITC-GMBP1能特異性結(jié)合于SGC7901/VCR和SGC7901

8、/ADR，而且結(jié)合能力明顯高于SGC7901，AGS，MKN45，GES和3T3細(xì)胞。 (8)激光聚焦顯微鏡顯示，F(xiàn)ITC-GMBP1能內(nèi)化入SGC7901/VCR和SGC7901/ADR，主要分布于胞漿中，并呈局部聚集特點(diǎn)。 (9)荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，F(xiàn)ITC-GMBP1能特異性的與SGC7901/ADR形成的腫瘤結(jié)合，明顯高于SGC7901形成的腫瘤，及心、腦、肺、脾、胃、肝、腸等組織。

9、(10)進(jìn)一步利用體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在(4)中發(fā)現(xiàn)的7個(gè)特異性結(jié)合噬菌體克隆，結(jié)果顯示GMBP8,GMBP42,GMBP46可以降低化療藥物的IC50值，其中GMBP42效果最明顯。 (11)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GMBP42合成多肽作用的SGC7901/VCR細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿、阿霉素的敏感性顯著升高；細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度并無明顯的改變。 (12)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示GMBP42合成多肽能夠增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的SGC7901/VC

10、R細(xì)胞凋亡；能夠使SGC7901/VCR細(xì)胞內(nèi)蓄積和潴留的阿霉素有所增加。 (13)荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感實(shí)驗(yàn)提示，與隨機(jī)多肽組SP相比，GMBP42合成多肽能夠有效地增強(qiáng)長(zhǎng)春新堿的治療效果。 研究結(jié)論： (1)獲得了7個(gè)在胃癌耐藥細(xì)胞與胃癌藥敏細(xì)胞上有差異性結(jié)合的噬菌體克隆(GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23,GMBP42,GMBP46)，并證實(shí)其中的GMBP1噬菌體及其呈現(xiàn)的十二肽GM

11、BP1均能與胃癌耐藥SGC7901/VCR和SGC7901/ADR細(xì)胞特異性結(jié)合，有可能成為胃癌多藥耐藥診斷的標(biāo)志分子或治療的靶向分子，為進(jìn)一步的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 (2)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)能夠逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細(xì)胞耐藥表型的噬菌體克隆(GMBP8,GMBP42,GMBP46)，并證實(shí)其中GMBP42多肽能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥SGC7901/VCR細(xì)胞的MDR表型，促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡，增加阿霉素的蓄積和潴留，有效地增強(qiáng)長(zhǎng)春新堿對(duì)荷瘤裸鼠的治