胃癌MDR細胞特異性結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽的篩選.pdf

1、本文研究目的：利用噬菌體呈現(xiàn)肽庫技術(shù)，以胃癌藥敏細胞及正常胃粘膜上皮永生化細胞為陰性細胞，采用消減篩選結(jié)合MTT藥物敏感試驗的方法，篩選能夠特異性結(jié)合并逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細胞MDR表型的短肽。 研究方法： (1)利用噬菌體隨機十二肽庫，以正常胃粘膜上皮細胞GES及胃癌藥敏細胞SGC7901為陰性吸附細胞，胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR為篩選靶細胞，進行全細胞消減篩選。 (2)篩選4輪后，

2、隨機挑取200個噬茵體克隆，利用單劑量化療藥物MTT體外藥物敏感實驗初步篩選出能夠降低胃癌耐藥細胞耐藥特性的噬菌體克隆。 (3)篩選出的克隆進行序列測定，并進行短肽序列的同源性分析。 (4)根據(jù)序列分析的結(jié)果，選擇重復(fù)次數(shù)多或有同源序列的噬菌體克隆，以ELISA法及結(jié)合實驗鑒定噬菌體與胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR或SGC7901/VCR的結(jié)合活性，排除假陽性或無差異結(jié)合的噬菌體。 (5)免疫細胞熒光染色

3、鑒定噬菌體與胃癌多藥耐藥細胞結(jié)合的特異性。 (6)人工合成陽性噬菌體呈現(xiàn)短肽，采用細胞結(jié)合競爭抑制實驗及競爭ELISA驗證合成肽對噬菌體與靶細胞結(jié)合的競爭性抑制作用。 (7)利用熒光標記的合成肽，以正常胃粘膜上皮細胞GES、多種胃癌藥敏細胞、3T3細胞為陰性對照，觀察陽性多肽與胃癌耐藥細胞結(jié)合的特異性。 (8)激光聚焦熒光顯微鏡檢測多肽結(jié)合的細胞部位。 (9)能夠特異性結(jié)合胃癌耐藥的陽性噬菌體克隆，利用M

4、TT篩選能高效逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細胞MDR表型的克隆。 (10)篩選到的噬菌體克隆，合成短肽，利用MTT實驗，流式細胞儀，初步探討其對胃癌多藥耐藥細胞MDR表型逆轉(zhuǎn)的機制。 (11)荷瘤裸鼠多肽體內(nèi)靶向?qū)嶒?；荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗。 研究結(jié)果： (1)在4輪的篩選中，每輪均加入2×1011PFU的噬菌體，并滴定每輪洗脫液中的噬菌體數(shù)量，計算噬菌體的產(chǎn)率，噬菌體在靶細胞SGC7901/ADR或SGC7901

5、/VCR上出現(xiàn)顯著富集，而對照細胞SGC7901、GES則保持低水平的結(jié)合或有不同程度的減少。 (2)隨機挑選200個噬菌體單克隆進行單劑量化療藥物MTT體外藥物敏感實驗初步篩選，與無關(guān)噬菌體及單用化療藥物相比發(fā)現(xiàn)其中161個克隆能夠提高化療藥物對細胞的抑制率。 (3)將這161個克隆測序，最終產(chǎn)生50個序列，經(jīng)BLAST分析，數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與這些短肽序列完全一致的蛋白質(zhì)分子，與部分蛋白質(zhì)有較高的同源性。 (4

6、)根據(jù)測序及生物信息學(xué)分析的結(jié)果，選取24個克隆進行ELISA法及結(jié)合實驗，結(jié)果顯示GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23這5個噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明顯的差異性結(jié)合；GMBP42,GMBP46這2個噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明顯的差異性結(jié)合。其中GMBP1噬菌體克隆與SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的結(jié)合能力均明顯高于SGC7901。

7、 (5)免疫細胞熒光染色顯示，GMBP1噬菌體在SGC7901/VCR和SGC7901/ADR上的結(jié)合明顯高于對照細胞SGC7901及GES。 (6)結(jié)合競爭抑制實驗及競爭ELISA顯示，GMBP1噬菌體與SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的結(jié)合及內(nèi)化能被其所呈現(xiàn)插入序列的人工合成肽GMBP1競爭抑制。 (7)熒光顯微鏡顯示，標記的多肽FITC-GMBP1能特異性結(jié)合于SGC7901/VCR和SGC7901

8、/ADR，而且結(jié)合能力明顯高于SGC7901，AGS，MKN45，GES和3T3細胞。 (8)激光聚焦顯微鏡顯示，F(xiàn)ITC-GMBP1能內(nèi)化入SGC7901/VCR和SGC7901/ADR，主要分布于胞漿中，并呈局部聚集特點。 (9)荷瘤裸鼠體內(nèi)靶向?qū)嶒灍晒怙@微鏡檢測顯示，F(xiàn)ITC-GMBP1能特異性的與SGC7901/ADR形成的腫瘤結(jié)合，明顯高于SGC7901形成的腫瘤，及心、腦、肺、脾、胃、肝、腸等組織。

9、(10)進一步利用體外藥物敏感實驗檢測，在(4)中發(fā)現(xiàn)的7個特異性結(jié)合噬菌體克隆，結(jié)果顯示GMBP8,GMBP42,GMBP46可以降低化療藥物的IC50值，其中GMBP42效果最明顯。 (11)MTT實驗結(jié)果顯示GMBP42合成多肽作用的SGC7901/VCR細胞對長春新堿、阿霉素的敏感性顯著升高；細胞的生長增殖速度并無明顯的改變。 (12)流式細胞儀檢測顯示GMBP42合成多肽能夠增強阿霉素誘導(dǎo)的SGC7901/VC

10、R細胞凋亡；能夠使SGC7901/VCR細胞內(nèi)蓄積和潴留的阿霉素有所增加。 (13)荷瘤裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗提示，與隨機多肽組SP相比，GMBP42合成多肽能夠有效地增強長春新堿的治療效果。 研究結(jié)論： (1)獲得了7個在胃癌耐藥細胞與胃癌藥敏細胞上有差異性結(jié)合的噬菌體克隆(GMBP1,GMBP6,GMBP8,GMBP9,GMBP23,GMBP42,GMBP46)，并證實其中的GMBP1噬菌體及其呈現(xiàn)的十二肽GM

11、BP1均能與胃癌耐藥SGC7901/VCR和SGC7901/ADR細胞特異性結(jié)合，有可能成為胃癌多藥耐藥診斷的標志分子或治療的靶向分子，為進一步的研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 (2)發(fā)現(xiàn)了3個能夠逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細胞耐藥表型的噬菌體克隆(GMBP8,GMBP42,GMBP46)，并證實其中GMBP42多肽能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥SGC7901/VCR細胞的MDR表型，促進阿霉素誘導(dǎo)的凋亡，增加阿霉素的蓄積和潴留，有效地增強長春新堿對荷瘤裸鼠的治