人組織型激肽釋放酶基因改善STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及腎臟保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病、高血壓時(shí)均有激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)活性的降低。在體和細(xì)胞水平研究均顯示，緩激肽(BK)可以通過與激肽BK2受體結(jié)合而增加胰島素所導(dǎo)致的葡萄糖攝取以及胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。我們的前期實(shí)驗(yàn)將重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)人組織型激肽釋放酶基因(rAAV-HK)導(dǎo)入STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可明顯改善大鼠的胰島素抵抗及發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不明確。為了進(jìn)一步探討HK防治糖尿病及其并發(fā)癥的機(jī)制及

2、在胰島素受體和受體下游環(huán)節(jié)進(jìn)行糖尿病基因治療的可能性，本實(shí)驗(yàn)在我們原有的工作基礎(chǔ)上，在體和細(xì)胞水平觀察激肽釋放酶基因?qū)σ葝u素相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行初步的探討。 方法和結(jié)果： 一.在體實(shí)驗(yàn) 前期實(shí)驗(yàn)中48只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為普通飼料組(16只)和高脂高糖飼料組(32只)，高脂高糖飼料組以小劑量STZ加高糖高脂飲食誘導(dǎo)2型糖尿病模型，隨機(jī)分為2組，分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入含人

3、類組織型激肽釋放酶基因的rAAV-HK(HK組)或含報(bào)告基因LacZ的rAAV-lacZ(LacZ組)，給藥后第12周處死動(dòng)物，并取心、肝、腎等組織作研究。本實(shí)驗(yàn)取前期實(shí)驗(yàn)中三組大鼠的心、肝、腎組織WesternBlot檢測HK蛋白質(zhì)在各臟器的表達(dá)分布情況及胰島素相關(guān)信號(hào)分子胰島素受體(IRβ)、PI3K、Akt的表達(dá)及其磷酸化的水平。采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)，并用western-blot的方法檢測凋亡

4、相關(guān)基因bcl-2/bax的表達(dá)。結(jié)果顯示rAAV介導(dǎo)的HK蛋白可在2型糖尿病大鼠的肝臟、腎臟、心臟表達(dá)，而且相較于LacZ組其表達(dá)增強(qiáng)。WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，三組總的胰島素受體(IRβ)、Akt的表達(dá)無明顯改變而其磷酸化水平P-IRβ、P-AKT及PI3K，相較于正常對照組，LacZ組明顯下調(diào)，而導(dǎo)入HK基因的HK組明顯上調(diào)，這可能為胰島素敏感性增加的原因之一。TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyltr

5、ansferase-mediatednickendlabelingassay)染色的結(jié)果顯示LacZ組腎臟凋亡細(xì)胞較同期對照組增多，而HK組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于LacZ組。并且WesternBlot結(jié)果表明HK基因可上調(diào)抑凋亡基因bcl*2而下調(diào)促凋亡基因bax的蛋白表達(dá)。 二.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 脂肪細(xì)胞富含胰島素受體。用0.5mmol/L的IBMX、1.0μmol/L的DEX和2mg/L的insulin將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘

6、導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，然后用緩激肽(BK)、BK的2型受體(BKR2)拮抗劑(HOE-140)及MAPK抑制劑(PD98059)、PI3K抑制劑(LY294002)和PKC抑制劑(H7)干預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞，WesternBlot方法檢測BK和HOE-140對胰島素相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRβ、AKT、MAPK的磷酸化水平和PI3K蛋白表達(dá)水平的影響。WesternBlot結(jié)果顯示：BK刺激脂肪細(xì)胞后，細(xì)胞IRβ、AKT、MAPK磷酸化水平和P

7、I3K蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而BKR2的抑制劑HOE能夠抑制其上調(diào)效應(yīng)。 結(jié)論：重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人類組織型激肽釋放酶基因改善胰島素抵抗及糖尿病大鼠的腎功能的作用機(jī)理可能為：(1)HK增加胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中IRβ、Akt蛋白的磷酸化水平和PI3K的蛋白表達(dá)(2)BK通過BKR2增加胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中IRβ、Akt、MAPK蛋白的磷酸化水平和PI3K的蛋白表達(dá)(3)HK上調(diào)腎組織的抑凋亡基因bcl-2而下調(diào)促凋亡基因b