胰島素抵抗與2型糖尿病大鼠組織脂肪酸譜的研究.pdf

1、目的:糖尿病,特別是2型糖尿病是近年來國內(nèi)外共同關(guān)注的熱點之一,胰島素抵抗是2型糖尿病的基本特征,也是導(dǎo)致2型糖尿病的關(guān)鍵危險因素。2001年美國糖尿病協(xié)會(ADA)會議上有學(xué)者指出,脂代謝異常與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系比與糖代謝異常的關(guān)系更為密切,在2型糖尿病中,脂代謝紊亂是糖代謝紊亂的根源,是糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理生理改變。血中及組織中的游離脂肪酸的升高會引起脂毒作用,進(jìn)而引起胰島素抵抗和糖尿病。因此,脂肪酸譜的研究對于糖尿

2、病的研究有重要意義。
　　 胰島素抵抗與糖尿病狀態(tài)下,機(jī)體糖利用障礙,脂肪動員加強(qiáng),脂肪酸氧化供能成為機(jī)體的主要能量來源。脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的氧化主要有兩條途徑:一是進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化,這條途徑主要氧化中短鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸(LCFA);二是進(jìn)入過氧化物酶體進(jìn)行β氧化,分解成短鏈脂肪酸。后者再經(jīng)線粒體β氧化徹底分解提供能量。該途徑主要氧化極長鏈脂肪酸(CLCFA),多不飽和脂肪酸(PUFA,包括:n-3 PUFA,n-6PUFA

3、))以及部分長鏈脂肪酸。這兩條途徑共同維持著脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)平衡,任何途徑障礙,都將導(dǎo)致脂肪酸在血和組織中聚集,導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病。其中,由過氧化物酶體β氧化途徑分解的極長鏈脂肪酸的蓄積,對細(xì)胞的損傷更大。
　　 目前已有的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病狀態(tài)下,患者血清中的總游離脂肪酸含量較正常人高,其中飽和脂肪酸(SFA)的含量升高,但C16:0、C18:0占總脂肪酸的比例降低;糖尿病大鼠的血清、肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織的脂

4、肪酸含量也有顯著變化。但是,在上述組織中,哪些脂肪酸升高了,哪些脂肪酸在胰島素抵抗與糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起了關(guān)鍵作用?是否是過氧化物酶體代謝相關(guān)的極長鏈脂肪酸?未見報道。為此,本文對此進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　 常用毛細(xì)管氣相色譜法對脂肪酸進(jìn)行定性、定量的測定。因為脂肪酸的熱穩(wěn)定性較差,須先對樣品中的脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理,并抽提后再進(jìn)行色譜測定,但目前尚無較好的可以同時測定C16-C26的飽和與不飽和脂肪酸譜的色譜條件,甲酯化C16-

5、C26脂肪酸的高效方法,以及抽提脂肪酸甲酯的方法。
　　 基于上述目的,本實驗首先確立了確定了氣相色譜測定C16-C26的飽和與不飽和脂肪酸譜的條件,優(yōu)化了大鼠血清及肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織的脂肪酸甲酯化方法和脂肪酸甲酯的提取方法,并用此方法測定分析了高脂飲食誘導(dǎo)的單純胰島素抵抗及糖尿病SD大鼠的血清、肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織中C16-C26的飽和與不飽和脂肪酸譜的變化,從而從游離脂肪酸的角度,探討其在胰島素抵抗

6、與糖尿病的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:
　　 1氣相色譜測定脂肪酸譜的方法的建立
　　 選用極性柱:Agilent DB-WAX聚乙二醇毛細(xì)管柱(30 m×0.53mm×1.00μm),將傳統(tǒng)的單階升溫程序改進(jìn)為三平臺二階升溫程序,在第一階升溫與第二階升溫之間添加一個190℃的58min的平臺期,以改進(jìn)后的方法對脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行測定,觀察改進(jìn)后的方法對于C16-C26的各種飽和與不飽和脂肪酸甲酯的分

7、離效果,并測定保留時間,測定并計算標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢出限、回收率及日內(nèi)日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
　　 2樣本游離脂肪酸的甲酯化及抽提條件的優(yōu)化
　　 以SD大鼠的肝組織為對象進(jìn)行探討,比較并將確定甲酯化試劑,及甲酯化后的最佳抽提次數(shù),測定優(yōu)化的方法的批內(nèi)及批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
　　 3以優(yōu)化后的方法確定血清及組織的最適用量。
　　 4大鼠血清及組織脂肪酸譜的測定
　　 分別取正常組、單純胰島素抵抗組、糖尿病

8、組SD大鼠的血清、肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織以已確定的方法進(jìn)行甲酯化、抽提并按已確定的方法進(jìn)行色譜分離,計算脂肪酸含量。
　　 5數(shù)據(jù)處理
　　 數(shù)據(jù)用-x±s表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,對所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗,單純胰島素抵抗組和糖尿病組均與對照組比較,用student's t檢驗(雙尾),檢驗以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1氣相色譜測定脂肪

9、酸譜的方法的建立
　　 1.1色譜條件的確定
　　 1.1.1色譜條件最終確定為:Agilent DB-WAX聚乙二醇毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1.00μm);初始柱溫150℃,10℃/min升溫至190℃,保持58min;20℃/min升溫至230℃,保持15 min;氮氣流量25mi/min,氫氣流量30ml/min,空氣流量400ml/min。進(jìn)樣1μ1。
　　 改進(jìn)后的色譜條件可將C16:0、C

10、16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C20:4、C20:5、C22:0、C22:4、C22:5、C22:6、C24:0、C26:0十五種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品一次分離,分離效果較好。
　　 1.2保留時間的確定
　　 各種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯的保留時間分別為:C16:07.104±0.012 min;C16:17.522±0.027 min;C18:011.023±0.009 min;C18:111

11、.594±0.020 min;C18:213.024±0.012 min;C18:315.390±0.008 min:C20:018.300±0.022 min;C20:425.385±0.014 min;C20:530.647±0.009 min;C22:032.232±0.014 min;C22:445.697±0.017 min;C22:555.726±0.022 min;C24:058.611±0.010 min;C22:660

12、.815±0.018 min;C26:071.426±0.025 min。
　　 1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定
　　 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的各脂肪酸甲酯的直線方程分別為:C16:0Y=1587.9X+2690(R2=0.9997);C16:1Y=1704.4X+48.867(R2=0.9998);C18:0Y=1731.8X+1041.6(R2=0.9997);C18:1Y=1719.5X+3260.7(R2=0.9997);C18

13、:2Y=3194.0X-1262.8(R2=0.9990);C18:3Y=3326.2X+32.191(R2=0.9997);C20:0Y=4978.2X-199.33(R2=0.9974);C20:4Y=1787.6X-742.95(R2=0.9991);C20:5Y=2057.8X-43.33(R2=0.9990);C22:0Y=1939.3X-47.97(R2=0.9988);C22:4Y=1200.5X+210.13(R2=0.

14、9998);C22:5Y=3006.3X+290.76(R2=0.9998);C24:0Y=1783.3X+45.32(R2=0.9993);C22:6Y=2673.1X-358.81(R2=0.9992);C26:0Y=2192.9X+95.102(R2=0.9985)。
　　 1.4最低檢出限的確定
　　 各種脂肪酸甲酯的最低檢出限分別為:C16:00.0783μg/ml;C16:10.0730μg/ml:C18:0

15、0.0718μg/ml:C18:10.0723μg/ml;C18:20.0390μg/ml;C18:30.0374μg/ml;C20:00.0250μg/ml;C20:40.0696μg/ml;C20:50.0605μg/ml;C22:00.0641μg/ml;C22:40.1036μg/ml;C22:50.0414μg/ml;C24:00.0698μg/ml;C22:60.0465μg/ml;C26:00.0567μg/ml。

16、　　 1.5回收率的測定
　　 各種脂肪酸甲酯的回收率在95.2％-107.5％之間。
　　 1.6相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的測定
　　 日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.37％-3.29％,日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.21％-5.74％。
　　 2樣本游離脂肪酸的甲酯化及抽提條件的優(yōu)化
　　 甲酯化試劑中,乙酰氯的催化效率最高;最佳抽提次數(shù)為三次;批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.94％-8.62％,批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為

17、2.33％-11.60％。
　　 3用于脂肪酸測定的血清及組織的最適用量
　　 血清、肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織的最適用量分別為:800μl、800mg、800mg、65mg、500mg。
　　 4單純胰島素抵抗及糖尿病大鼠的血清、肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織的游離脂肪酸的變化
　　 4.1與正常組相比較,胰島素抵抗大鼠的脂肪酸譜的變化:
　　 血清中,總脂肪酸、SFA、UFA、SFA/

18、UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、LCFA、VLCFA顯著升高,n-6PUFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。肝組織中,SFA/UFA、n-3PUFA/n-6PUFA顯著升高,n-3PUFA、n-6PUFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 心肌組織中,總脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 腦組織中,n-3PUFA、VLCFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)

19、意義。
　　 腎組織中,總脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA顯著升高,n-3PUFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.2與正常組相比較,糖尿病大鼠的脂肪酸譜的變化:
　　 血清中,總脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA、VLCFA有顯著升高,n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 肝組織中,SFAl/UFA、n-3PUFA、n-

20、3PUFA/n-6PUFA、VLCFA有顯著升高,UFA、n-6PUFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 心肌組織中,總脂肪酸、SFA、UFA、n-6PUFA、LCFA顯著升高,SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PIJFA/n-6PUFA、VLFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 腦組織中,SFA/UFA顯著升高,總脂肪酸、UFA、n-3PUFA、n-6PUFA、n一3PUFA/n-6PUFA、LCFA、VL

21、CFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 腎組織中,總脂肪酸、SFA、UFA、SFA/UFA、LCFA顯著升高,n-3PUFA、n-6PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、VLCFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.3與胰島素抵抗組相比較,糖尿病大鼠的脂肪酸譜的變化:
　　 血清中,n-6PUFA顯著升高,SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、VLCFA顯著降低,差異均有統(tǒng)

22、計學(xué)意義。
　　 肝組織中,n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、VLCFA顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 心肌組織中,總脂肪酸、UFA、n-6PUFA、LCFA顯著升高,SFA/UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、VLFA顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 腦組織中,SFA/UFA顯著升高,UFA、n-3PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA有顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

23、。
　　 腎組織中,n-3PUFA、n-6PUFA、n-3PUFA/n-6PUFA、VLCFA顯著降低,以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1建立了氣相色譜測定C16-C26的游離脂肪酸譜的方法。方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性良好,可作為C16-C26游離脂肪酸譜常規(guī)檢測的有用工具。
　　 2胰島素抵抗及糖尿病狀態(tài)下,血清中的脂肪酸含量的升高涉及長鏈及極長鏈脂肪酸水平的升高。
　　 3單純胰島素抵

24、抗?fàn)顟B(tài)及糖尿病狀態(tài)下,SD大鼠的肝組織、心肌組織、腦組織、腎組織中脂肪酸譜的變化各不相同:
　　 肝組織中,總脂肪酸含量的升高與極長鏈脂肪酸的升高有關(guān),其中C22:6升高顯著;
　　 心肌組織中,總脂肪酸含量的升高與長鏈脂肪酸的升高有關(guān),但是C22:6降低顯著;
　　 腦組織中,總脂肪酸含量的升高與C16以上的脂肪酸無關(guān),C22:6顯著降低;
　　 腎組織中,總脂肪酸含量的升高與長鏈脂肪酸的升高有關(guān),C2