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1、立題依據(jù)資料表明,由于多種原因,在我國(guó)確有不少已肯定能預(yù)防的食源性寄生蟲病,如肺吸蟲病、華枝睪吸蟲病、豬(牛)帶絳蟲病、囊蟲病、裂頭蚴病、旋毛蟲病和弓形體病等,在我國(guó)部分地區(qū)的城鄉(xiāng)感染嚴(yán)重。 目前,對(duì)于此類食源性寄生蟲病的診斷技術(shù)主要包括病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查三個(gè)方面。該類疾病難以獲得病原學(xué)診斷依據(jù),臨床極易誤診,耽誤病程,造成患者不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);分子生物學(xué)的檢查技術(shù)條件要求很高,目前尚僅限于實(shí)驗(yàn)室試用階
2、段;因此,免疫學(xué)診斷成為國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn),希望能夠研究開發(fā)敏感性高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)易、反應(yīng)快速、微量準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的食源性寄生蟲病診斷技術(shù)與方法。 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-enzyme-linkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)是近年新發(fā)展的一種ELISA技術(shù),選用對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)吸附能力的硝酸纖維素薄膜作固相載體,底物經(jīng)酶促反應(yīng)后形成有色沉淀物使薄膜著色,然后目測(cè)或用光密度掃
3、描儀定量分析,該法具有微量、快速、經(jīng)濟(jì)、方便等特點(diǎn),可用于檢測(cè)抗體或抗原,這項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床免疫診斷,且能獲得較好的敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)結(jié)果。 目的:鑒此,本課題旨在根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理,建立SPCT-dot-ELISA,以期獲得較理想的敏感性高、特異性強(qiáng)的寄生蟲病檢測(cè)結(jié)果,從而為臨床寄生蟲病免疫學(xué)診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1、SPCT-dot-ELISA的建立及靈敏性和特異性指標(biāo)的檢
4、測(cè)制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)、肺吸蟲成蟲可溶性抗原(PwA)、囊蟲抗原(CcA)、旋毛蟲蚴蟲可溶性抗原(TsA);BCA法測(cè)定抗原含量;將四種可溶性抗原包被在同一硝酸纖維素膜;封閉液封閉;加入病原學(xué)陽(yáng)性確診35份及10份陰性待檢血清置4℃冰箱過(guò)夜;0.05%PBST第一次洗滌;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(1:500)室溫孵育2h;0.05%PBST第二次洗滌;加底物顯色。 2、對(duì)比試劑盒平行ELISA試驗(yàn)
5、 用深圳市綠瀚、深圳市博卡ELISA試劑檢測(cè)35份病原學(xué)確證陽(yáng)性患者血清及陰性血清。 3、800份臨床樣品試驗(yàn) SPCT-dot-ELISA檢測(cè)800份臨床樣品,同時(shí)比較二種國(guó)內(nèi)主要生產(chǎn)ELISA試劑盒廠商ELISA試劑產(chǎn)品,進(jìn)行平行試驗(yàn),并統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: 1、SPCT-dot-ELISA靈敏性、特異性指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 所有質(zhì)控點(diǎn)均呈藍(lán)色,10份日本血吸蟲病患者血清在SEA點(diǎn)均呈藍(lán)色,10份
6、肺吸蟲病患者血清在PwA點(diǎn)均呈藍(lán)色,10份囊蟲病患者血清在CcA點(diǎn)均呈藍(lán)色,5份旋毛蟲病患者血清在TsA點(diǎn)均呈藍(lán)色。10份陰性對(duì)照血清顯示所有質(zhì)控點(diǎn)均呈藍(lán)色,日本血吸蟲、肺吸蟲、囊蟲和旋毛蟲各標(biāo)記點(diǎn)無(wú)顯色反應(yīng)。 2、對(duì)比試劑盒平行ELISA試驗(yàn)結(jié)果 用深圳市綠瀚、博卡ELISA試劑進(jìn)行病原學(xué)確證陽(yáng)性患者血清10份日本血吸蟲病、10份肺吸蟲病、10份囊蟲病、5份旋毛蟲病的檢測(cè):除旋毛蟲ELISA法1份綠瀚、博卡是陰性,占2
7、0%,其它均是陽(yáng)性。10份陰性血清檢測(cè)結(jié)果:綠瀚試劑旋毛蟲2份弱陽(yáng)性,占40%,其它均為陰性;博卡試劑血吸蟲1份陽(yáng)性,占10%,旋毛蟲1份陽(yáng)性,占20%,其它均為陰性。 3、800份臨床檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果 SPCT-dot-ELISA檢測(cè)CcA7例陽(yáng)性(4例符合)、TsA15例陽(yáng)性(12例符合),SEA、PwA為陰性。綠瀚800例中88例陽(yáng)性,博卡462例陽(yáng)性;其中肺吸蟲中綠瀚16例陽(yáng)性,博卡52例;囊蟲中綠瀚3例陽(yáng)性,博
8、卡169例;旋毛蟲綠瀚35例陽(yáng)性,博卡111例陽(yáng)性;肝吸蟲和血吸蟲相似,綠瀚檢測(cè)陽(yáng)性分別為20和21例,博卡檢測(cè)陽(yáng)性123例和71例。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)較成功的建立了SPCT-dot-ELISA,該法具有如下特點(diǎn): 1、檢測(cè)范圍廣:能同時(shí)檢測(cè)血吸蟲病、肺吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病4種寄生蟲病患者血清中的特異抗體。 2、陽(yáng)性檢出率高:經(jīng)病原學(xué)確證的陽(yáng)性血清采用該法陽(yáng)性檢出率為100%。 3、交叉反應(yīng)率低:肺吸蟲與
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