Dot-ELISA檢測(cè)犬惡絲蟲抗體方法的建立及犬惡絲蟲可溶性蛋白的抗原性研究.pdf

1、犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲引起的呈世界性分布的寄生蟲病，該病嚴(yán)重影響犬貓及小熊貓、狼、狐等多種野生肉食動(dòng)物的健康。 感染犬惡絲蟲病嚴(yán)重的動(dòng)物有明顯的臨床癥狀，容易確診。而輕度感染、感染早期或夏季潛伏期病例卻較難發(fā)現(xiàn)，因此該病的早期診斷比較困難。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于犬惡絲蟲病診斷方面的報(bào)道主要是病原學(xué)診斷，而國(guó)外資料報(bào)道犬惡絲蟲的可檢測(cè)血清抗體水平往往比典型的臨床癥狀出現(xiàn)得早，且血清學(xué)診斷方法比臨床診斷方法有更高的檢出率，因此本研究用提取的可

2、溶性蛋白作為診斷抗原建立了檢測(cè)犬惡絲蟲病血清抗體的Dot-EIASA方法。診斷抗原是將收集的犬惡絲蟲經(jīng)反復(fù)凍融、研磨、離心的方法獲得。通過反復(fù)篩選，確定了該法的最佳反應(yīng)條件：抗原最適包被濃度為16.41 μg/ml，包被溫度和時(shí)間為37℃30 min，封閉液為1％BSA.，封閉條件為37℃50 min，抗原抗體反應(yīng)條件為37℃60 min，辣根過氧化酶標(biāo)記的SPA(HRP-SPA)最適工作濃度為1:4000，孵育條件為37℃60 min

3、，底物作用時(shí)間為20 min，血清稀釋液和洗滌液均為0.01M pH7.4 PBST(含0.2％Tween-20)。阻斷試驗(yàn)和交叉試驗(yàn)表明診斷膜片具有良好的特異性：不與犬蠕形螨高免血清、犬鉤口線蟲高免血清、犬弓首蛔蟲血清等陽(yáng)性血清反應(yīng)；膜片具有良好的靈敏性，高免血清作1：2<'8>稀釋亦能檢出；重復(fù)性試驗(yàn)表明該法重復(fù)性良好。診斷膜片保存期長(zhǎng)，在4℃保存12個(gè)月其檢測(cè)活性不變。該方法操作簡(jiǎn)便快捷，3.5小時(shí)內(nèi)即可完成。結(jié)果表明Dot-EL

4、ISA簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異，重復(fù)性好，結(jié)果客觀、穩(wěn)定，肉眼容易判定，不需要特殊儀器，診斷膜便于寄送、保存，各種試劑和材料都可作到標(biāo)準(zhǔn)化。Dot-ELISA為犬惡絲蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了良好的技術(shù)手段。 為了尋找診斷犬惡絲蟲病的特異性抗原，本研究應(yīng)用SDS-PAGE對(duì)提取的犬惡絲蟲可溶性抗原組分進(jìn)行分析，然后用犬惡絲蟲高免血清、自然感染犬惡絲蟲血清和陰性血清進(jìn)行免疫印跡(Western blot)。電泳結(jié)果表明提取的粗抗