人血清脂聯(lián)素定量ELISA檢測(cè)方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:利用基因工程技術(shù),克隆、表達(dá)和純化具有生物活性的人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(gAPN)重組蛋白,建立一種簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)人血清脂聯(lián)素(APN)濃度的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),進(jìn)一步探討其與冠心?。–HD)的關(guān)系。 方法:1.利用基因克隆技術(shù),構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET22b-gAPN,在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中重組表達(dá)、純化人gAPN重組蛋白,并通過(guò)觀察鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的高血糖小鼠模型血糖改變驗(yàn)證其生物學(xué)活性。2.用抗APN單克

2、隆抗體包被微孔板,10%小牛血清為封閉液,另一針對(duì)APN不同抗原表位的單克隆抗體生物素化后作為檢測(cè)抗體,聯(lián)合生物素.鏈霉親和素信號(hào)放大系統(tǒng),以重組的gAPN蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立檢測(cè)人血清APN濃度的定量ELISA方法。3.利用建立的ELISA方法,檢測(cè)161例臨床血清樣本APN水平,經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果確診CHD患者共103例,非CHD患者58例,進(jìn)一步分析血清APN與CHD發(fā)病、冠狀動(dòng)脈病變狹窄嚴(yán)重程度及CHD危險(xiǎn)因子之間的關(guān)

3、系。 結(jié)果:1.成功構(gòu)建了pET22b-gAPN質(zhì)粒,獲得了人gAPN重組蛋白(分子量約15kD),可溶性尚可,產(chǎn)量較高(1.57mg),純度>90%。Western印跡鑒定其具有抗原活性,且該蛋白具有降低高血糖小鼠模型血糖的生物學(xué)活性。2.成功建立了檢測(cè)人血清APN含量的ELISA方法。該檢測(cè)方法的靈敏度為150pg/ml,血清檢測(cè)準(zhǔn)確性、特異性、線性、重復(fù)性好,回收率為91.0%-108.0%。與國(guó)內(nèi)深圳依諾金科技有限公司的

4、人APN濃度ELISA定量檢測(cè)試劑盒的相關(guān)性良好(r=0.935,P<0.001)。3.臨床檢測(cè)表明,CHD組APN濃度明顯低于非CHD組[5.67(2.59-10.47)mg/L VS7.14(4.37-11.40)mg/L,P<0.01];非CHD組中,女性血清APN濃度高于男性[8.92(5.84-15.53)mg/L VS4.68(3.11-9.05)mg/L,P<0.01],而在CHD組中,女性血清APN卻低于男性[4.20(

5、1.83-6.05)mg/L VS5.96(2.71-10.90)mg/L],但差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著Gensini積分升高,冠狀動(dòng)脈狹窄程度加重,APN含量降低,但各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清APN濃度與hs-CRP濃度和Gensini積分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.253,r=-0.162,P<0.05),與HDL-C水平呈明顯正相關(guān)(r=0.213,P<0.01)。 結(jié)論:成功克隆了人gAPN基因,并表達(dá)出具有生物學(xué)

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