人血清脂聯(lián)素定量ELISA檢測方法的建立及初步臨床應用.pdf

1、目的：利用基因工程技術，克隆、表達和純化具有生物活性的人脂聯(lián)素球狀結構域（gAPN）重組蛋白，建立一種簡便、快捷的檢測人血清脂聯(lián)素（APN）濃度的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），進一步探討其與冠心病（CHD）的關系。 方法：1.利用基因克隆技術，構建表達質(zhì)粒pET22b-gAPN，在原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中重組表達、純化人gAPN重組蛋白，并通過觀察鏈脲佐菌素（STZ）誘導的高血糖小鼠模型血糖改變驗證其生物學活性。2.用抗APN單克

2、隆抗體包被微孔板，10％小牛血清為封閉液，另一針對APN不同抗原表位的單克隆抗體生物素化后作為檢測抗體，聯(lián)合生物素.鏈霉親和素信號放大系統(tǒng)，以重組的gAPN蛋白為標準品繪制標準曲線，建立檢測人血清APN濃度的定量ELISA方法。3.利用建立的ELISA方法，檢測161例臨床血清樣本APN水平，經(jīng)冠狀動脈造影結果確診CHD患者共103例，非CHD患者58例，進一步分析血清APN與CHD發(fā)病、冠狀動脈病變狹窄嚴重程度及CHD危險因子之間的關

3、系。 結果：1.成功構建了pET22b-gAPN質(zhì)粒，獲得了人gAPN重組蛋白（分子量約15kD），可溶性尚可，產(chǎn)量較高（1.57mg），純度>90％。Western印跡鑒定其具有抗原活性，且該蛋白具有降低高血糖小鼠模型血糖的生物學活性。2.成功建立了檢測人血清APN含量的ELISA方法。該檢測方法的靈敏度為150pg/ml，血清檢測準確性、特異性、線性、重復性好，回收率為91.0％-108.0％。與國內(nèi)深圳依諾金科技有限公司的

4、人APN濃度ELISA定量檢測試劑盒的相關性良好（r=0.935，P<0.001）。3.臨床檢測表明，CHD組APN濃度明顯低于非CHD組[5.67（2.59-10.47）mg/L VS7.14（4.37-11.40）mg/L，P<0.01]；非CHD組中，女性血清APN濃度高于男性[8.92（5.84-15.53）mg/L VS4.68（3.11-9.05）mg/L，P<0.01]，而在CHD組中，女性血清APN卻低于男性[4.20（

5、1.83-6.05）mg/L VS5.96（2.71-10.90）mg/L]，但差別沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。隨著Gensini積分升高，冠狀動脈狹窄程度加重，APN含量降低，但各組間無統(tǒng)計學差異。血清APN濃度與hs-CRP濃度和Gensini積分呈負相關（r=-0.253，r=-0.162，P<0.05），與HDL-C水平呈明顯正相關（r=0.213，P<0.01）。 結論：成功克隆了人gAPN基因，并表達出具有生物學