應用PCR及DoT-ELISA技術(shù)建立肝片吸蟲檢測方法的研究.pdf

1、肝片吸蟲是一種人獸共患寄生蟲，該寄生蟲能夠感染包括人在內(nèi)的許多哺乳動物。受片形吸蟲感染的動物臨床癥狀主要是急性或慢性肝炎和膽管炎。建立快速、方便且較為特異、靈敏的肝片吸蟲檢測方法，對于及時診斷片形吸蟲病、進行流行病學調(diào)查以及建立片形吸蟲病防控預警系統(tǒng)有重要作用。
　　本研究建立了基于第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（its-2）基因的肝片吸蟲普通PCR及SYBR Green熒光定量PCR檢測方法。通過對反應體系和反應條件的優(yōu)化，普通PCR敏感性為

2、212 fg/μl。SYBR Green熒光定量PCR敏感性達到0.167 fg/μl，比普通PCR高3個數(shù)量級，組內(nèi)重復性試驗的變異系數(shù)在0.13％-1.06％之間，組間重復性試驗的變異系數(shù)在0.15％-1.46％之間，均小于2％，說明該方法具有良好的重復性。本研究建立的普通PCR和SYBR Green熒光定量PCR均能以肝片吸蟲基因組為模板擴增出目的條帶或擴增曲線，與微小隱孢子蟲、羊蛔蟲、小型艾美耳球蟲、大腸桿菌、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組

3、無交叉反應，顯示出較好的特異性。對浙江嘉興地區(qū)羊場采集的共250份糞樣進行流行病學調(diào)查，糞便鏡檢法共檢出陽性樣本2份，陽性率為0.8％。普通PCR方法檢出陽性樣本7份，陽性率為2.8％。熒光定量PCR檢測出陽性樣本8份，陽性檢出率為3.2％，經(jīng)測序，檢出的陽性樣本與目的基因相似性在99％以上，兩種PCR方法靈敏性和特異性均較高。
　　本研究還利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達的羊肝片吸蟲硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)為診斷抗原，建立了羊

4、肝片吸蟲感染斑點酶聯(lián)吸附試驗(Dot-ELISA)檢測方法。研究顯示，重組蛋白大小約30 kDa，各組分的最適反應條件為:抗原最適包被量為0.28μg/片，血清最佳工作濃度和工作時間分別為1∶400和30 min，酶標二抗最佳工作濃度和工作時間分別為1∶800和45 min，血清和酶標二抗最佳反應溫度均為37℃，最適封閉液和封閉條件分別為2％BSA-TBS和37℃2 h，最佳顯色時間30 min。特異性試驗顯示該方法與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、細粒

5、棘球蚴、土耳其斯坦東畢吸蟲陽性血清無交叉反應。該方法靈敏度高、重復性好。但該Dot-ELISA與大片吸蟲是否存在交叉反應需要進一步的研究。運用該方法對浙江海寧和桐鄉(xiāng)共200份羊血清樣本進行檢測，陽性率為1.5％，提示浙江海寧和桐鄉(xiāng)對羊肝片吸蟲感染控制較好。
　　綜上所述，本研究建立的普通PCR具有較好的特異性，并首次建立了基于its-2基因的肝片吸蟲SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，本研究還應用硫氧還蛋白過氧化物酶重組蛋