毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、肺癌是一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中，小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)占原發(fā)肺癌的15％～25％，其倍增時(shí)間短、生長(zhǎng)快，很早就發(fā)生全身轉(zhuǎn)移。90％的SCLC患者首選放療和化療。雖然對(duì)放、化療敏感，但SCLC是近30年來(lái)所有治療敏感的腫瘤中最容易復(fù)發(fā)、預(yù)后最差的一種。有鑒于此，在放、化療的基礎(chǔ)上，尋找更有效的藥物作為一種輔助治療手段對(duì)SCLC的治療有重要意義。
　　 近年來(lái)，非神經(jīng)元性膽堿能信號(hào)通路

2、與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能夠自分泌或旁分泌乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)，作用于自身或鄰近細(xì)胞上的煙堿型膽堿受體(nicotinic cholinergic receptors，NRs)和毒蕈堿型膽堿受體(muscarinic cholinergic receptors，MRs)，調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等。MRs有5個(gè)亞型(M1R～M5R)，研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、前列腺癌等都有MRs的表達(dá)，而且

3、MRs拮抗劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管發(fā)生、細(xì)胞遷移并增加凋亡等，其中尤以M3R為重要。但有關(guān)M3R和SCLC的研究報(bào)道不多，M3R在SCLC細(xì)胞增殖中作用的研究結(jié)果還不一致，M3R在SCLC其他方面如腫瘤細(xì)胞黏附、遷移及侵襲中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 M3R拮抗劑在臨床上治療慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間，具有很好的安全性和療效。如果在體外證實(shí)

4、了SCLC細(xì)胞株表達(dá)M3R且M3R拮抗劑能夠抑制SCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和黏附等，將為進(jìn)一步研究M3R拮抗劑作為SCLC輔助治療的一種手段提供試驗(yàn)和理論依據(jù)，也許能夠?yàn)镾CLC尤其是同時(shí)合并COPD患者的治療帶來(lái)新的希望?；谏鲜隹紤]，我們做了如下的研究。
　　 第一章、體外人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)
　　 目的：體外培養(yǎng)人SCLC細(xì)胞株SBC3和H82并觀察其生長(zhǎng)特性，以備后續(xù)試驗(yàn)所用。
　　 方法：體外培養(yǎng)

5、SBC3和H82細(xì)胞，采用cell counting kit-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞有無(wú)支原體污染。
　　 結(jié)果：SBC3和H82細(xì)胞傳代后經(jīng)過(guò)大概24h潛伏期，至48h及72h進(jìn)入大量分裂的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。大概96h，細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，生長(zhǎng)緩慢并停止，進(jìn)入平臺(tái)期，然后退化衰亡(圖2)。SBC3和H82細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間平均吸光度(opticaldensity，OD)值見(jiàn)表1。試驗(yàn)

6、所用人SCLC細(xì)胞株SBC3和H82沒(méi)有支原體的污染。
　　 結(jié)論：SBC3和H82體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，此研究所培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞SBC3和H82細(xì)胞沒(méi)有被支原體污染，培養(yǎng)至48h及72h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，是行M3R受體檢測(cè)及功能試驗(yàn)的最佳時(shí)間。
　　 第二章、毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)
　　 目的：明確SCLC細(xì)胞株SBC3和H82是否表達(dá)M3R，以進(jìn)一步行M3R在SCLC中功能的研究。
　　 方法：

7、體外培養(yǎng)人SCLC細(xì)胞株SBC3和H82，采用RT-PCR及Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞M3R mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：如圖3、圖4所示，SBC3和H82細(xì)胞均有特異性M3RmRNA和蛋白的表達(dá)。SBC3細(xì)胞M3R mRNA的表達(dá)強(qiáng)于H82細(xì)胞，以β-actin標(biāo)化后的SBC3細(xì)胞M3R蛋白表達(dá)強(qiáng)度為H82細(xì)胞的2.65倍(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：人SCLC細(xì)胞株SBC3和H82表達(dá)M3R

8、，M3R表達(dá)水平在兩細(xì)胞株間存在差異。SBC3細(xì)胞株M3R表達(dá)明顯強(qiáng)于H82，故選擇SBC3細(xì)胞株進(jìn)一步研究M3R在SCLC中的功能。
　　 第三章、毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌中的功能研究
　　 第一節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌增殖中的作用
　　 目的：研究M3R在SCLC細(xì)胞增殖中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人SCLC細(xì)胞株SBC3，采用MTT比色法研究膽堿受體激動(dòng)劑碘化乙酰膽堿(acetych

9、oline iodide，Ach)及選擇性M3R拮抗劑4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide(4-DAMP)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。試驗(yàn)分組如下：①正常對(duì)照組；②不同濃度Ach組(10-6、10-5、10-4、10-3M)；③Ach(10-4M)+不同濃度4-DAMP組(10-8、10-7、10-6、10-5M)；④不同濃度4-DAMP組(10-8、10-7、10-6、10-5M)。分別

10、于0、24、48、72h通過(guò)檢測(cè)550 nm/650nm OD值判定各組中活細(xì)胞數(shù)量。
　　 結(jié)論:外源性Ach濃度依賴(lài)性地刺激SCLC增殖，M3R拮抗劑能夠阻斷Ach的作用。無(wú)外源性Ach的條件下，M3R拮抗劑亦能夠抑制SCLC的增殖。
　　 第二節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌遷移、侵襲中的作用
　　 目的:研究M3R對(duì)SCLC細(xì)胞遷移的影響及M3R在基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix me

11、talloproteinase，MMP-2和MMP-9)誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人SCLC細(xì)胞株SBC3，采用Boyden侵襲小室法研究膽堿受體激動(dòng)劑Ach及選擇性M3R拮抗劑4-DAMP對(duì)細(xì)胞遷移的作用。試驗(yàn)分組如下：①不同濃度Ach組(10-7、10-6、10-5和10-4M)；②不同濃度4-DAMP(10-7、10-6、10-5M)+10-4M Ach組。顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(400×)細(xì)胞數(shù)求平

12、均值后記做遷移細(xì)胞數(shù)。采用明膠酶譜法分析測(cè)定不同濃度Ach(10-6、10-5、10-4M)對(duì)SBC3細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的影響，試驗(yàn)分組如下：①VA13細(xì)胞培養(yǎng)液為陽(yáng)性對(duì)照；②RPMI-1640尤血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照；③不同濃度Ach(10-6、10-5、10-4M)作用后的SBC3細(xì)胞培養(yǎng)液。
　　 結(jié)論:Ach刺激SCLC向Fn的遷移，M3R拮抗劑阻斷Ach的作用。各濃度Ach不影響SBC3細(xì)胞MMP-2和M

13、MP-9的表達(dá)，M3R在MMP-2和MMP-9誘導(dǎo)的SBC3細(xì)胞侵襲中可能沒(méi)有作用。
　　 第三節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細(xì)胞肺癌黏附中的作用
　　 目的:研究M3R在SCLC黏附中的作用及其影響機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)人SCLC細(xì)胞株SBC3，采用流式細(xì)胞法檢測(cè)整合素的表達(dá)，相同方法觀察膽堿受體激動(dòng)劑Ach和選擇性M3R拮抗劑4-DAMP對(duì)SBC3細(xì)胞所表達(dá)的整合素的影響。Ach、4-DAMP及整合素抗體對(duì)S

14、BC3細(xì)胞黏附的作用用人Fn包被的96孔板來(lái)研究。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Fn包被的孔中加入未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，F(xiàn)n包被孔加入不同藥物處理的細(xì)胞的試驗(yàn)分組如下：①10-4M Ach+10-5M4-DAMP；②10-4MAch+5μg/ml抗人αv整合素抗體；③10-4M Ach+5μg/ml抗人α5整合素抗體；④10-4M Ach+5μg/ml抗人αv和α5整合素抗體；⑤1

15、0-4M Ach+5μg/ml抗人β1整合素抗體；⑥10-4MAch。顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(200×)細(xì)胞數(shù)求平均值記做黏附細(xì)胞數(shù)。
　　 結(jié)論:M3R拮抗劑抑制體外SCLC的黏附，這種作用是通過(guò)抑制細(xì)胞表面含β1的整合素(αvβ1和α5β1)的功能實(shí)現(xiàn)的，而不能改變整合素的表達(dá)水平。
　　 本研究得到下列結(jié)論：
　　 1.人SCLC細(xì)胞株SBC3和H82均表達(dá)M3R，M3R可能為SCLC治療潛在的新的靶點(diǎn)。

16、
　　 2.外源性Ach濃度依賴(lài)性地刺激SCLC細(xì)胞增殖，M3R拮抗劑能夠阻斷Ach刺激的細(xì)胞增殖。
　　 3.在沒(méi)有外源性Ach的情況下，M3R拮抗劑亦可以阻斷SCLC細(xì)胞增殖，說(shuō)明SCLC能夠自分泌內(nèi)源性Ach，Ach做為一種生長(zhǎng)因子通過(guò)作用于M3R，刺激細(xì)胞的增殖。
　　 4.外源性Ach濃度依賴(lài)性地刺激SCLC細(xì)胞的遷移，M3R拮抗劑阻斷Ach的作用，說(shuō)明在體外M3R拮抗劑能夠抑制SCLC的遷移。