可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實驗研究.pdf

1、雖然只有5-10％重癥復(fù)發(fā)性哮喘對吸入激素?zé)o效，但由于其高死亡率和發(fā)病率仍引起人們的高度關(guān)注。對這類患者治療手段及其有限，因此迫切要求一些新的治療方法。研究證明腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細胞因子，參與哮喘的多個病理生理過程。它可以增加細胞間的粘附分子表達，使中性粒細胞和嗜酸細胞向氣道內(nèi)遷移，釋放細胞毒素，導(dǎo)致氣道損傷，反復(fù)的氣道損傷修復(fù)又導(dǎo)致氣道重構(gòu)。初步研究證實以TNF抑制劑為代表的生物制劑可有效改善重

2、癥復(fù)發(fā)性哮喘的氣道高反應(yīng)性，肺功能及提高生活質(zhì)量并減少復(fù)發(fā)次數(shù)，成為近年來研究哮喘治療的一個熱點。 腺病毒是目前用于基因轉(zhuǎn)移最廣泛的載體之一，具有感染譜廣、安全性高、容量大、體外可操作性好等優(yōu)點。新型AdMax系統(tǒng)通過重組酶在真核細胞內(nèi)完成重組出毒，高效且穩(wěn)定，是目前最簡便快捷的腺病毒載體系統(tǒng)，利用重組腺病毒載體表達可溶性TNFRI，可以局部封閉氣道內(nèi)高濃度TNF-α，這對重度難治性哮喘的治療提供了一個新的選擇。通過霧化吸人方式

3、將目的基因轉(zhuǎn)入，這樣不僅可以保證使目的基因在肺臟局部發(fā)揮作用，還可以減小由體循環(huán)注人引起的副作用。 基于以上研究，本實驗設(shè)計并制備攜帶人sTNFR1-IgGFc融合基因的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染人氣道上皮細胞系(HBE135-E6E7)及人氣道平滑肌細胞(HASMCs)，并對轉(zhuǎn)染后細胞中sTNFR1-IgGFc的表達及拮抗TNF活性進行檢測，研究其抑制氣道平滑肌細胞增殖的作用。同時建立慢性哮喘小鼠模型，研究經(jīng)鼻滴入重組腺病毒Ad-s

4、TNFR1-IgGFc治療哮喘的作用，以探索出一種治療重癥頑固性哮喘的新的方法，為其在臨床上應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外還未見TNFR1-IgGFc融合基因治療哮喘的報道。 本研究分以下二方面進行對可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實驗研究 第一部分：重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc融合基因構(gòu)建、表達及其拮抗TNF作用 一、研究方法： 設(shè)計上游引物：5'-ATGAGCTCATGGGCCT

5、CTCCACCGTGCCTG-3'引入SacI位點，下游引物：5'-ATGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3'引入SalI位點，以質(zhì)粒pBluescrip/TNFR1-IgGFc為模板，PCR擴增sTNFRI-IgGFc基因，將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α，提取質(zhì)粒，DNA測序正確后，以SacI及SalI雙酶切，回收1，332bp片段，插入穿梭載體pDC316的相同位點，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)

6、化DH5α感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。將穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFR1-IgGFc、輔助質(zhì)粒pBHGlox△E1，3Cre與脂質(zhì)體的混合物轉(zhuǎn)染293細胞，重組產(chǎn)生Ad-sTNFR1-IgGFe，PER鑒定毒種正確后，進行擴增、純化，50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)計算病毒滴度。采用流式細胞術(shù)檢測病毒感染效率。RT-PER檢測sTNFR1-IgGFcmRNA表達，采用即用型SABC免疫組化染色試劑盒，以1:100稀釋的兔抗T

7、NFR1抗體為一抗，免疫組化法檢測sTNFR1-IgGFc蛋白表達，采用TNFR1ELISA檢測試劑盒檢測腺病毒轉(zhuǎn)染的人氣道平滑肌細胞(HASMCs)上清中sTNFR1-IgGFc蛋白表達量。以TNF敏感的L929細胞為靶細胞，加入倍比稀釋轉(zhuǎn)染病毒的細胞上清及100μL含2ngTNF-α和2μg/mL絲裂霉素C，采用MTT法檢測表達sTNFR1-IgGFc的ItBE135-E6E7細胞上清對TNF-α的拮抗活性；采用MTT法檢測表達sT

8、NFR1-IgGFc的細胞上清對TNF-α促人氣道平滑肌細胞增殖能力的影響。 二、研究結(jié)果： 實驗結(jié)果證明成功構(gòu)建了Ad-sTNFR1-IgGFc腺病毒載體，感染性滴度達3×1010TCID50/ml，200moi轉(zhuǎn)染然人氣道上皮細胞陽性率為90.2％，轉(zhuǎn)染人平滑肌細胞陽性率達99.32％，轉(zhuǎn)染后細胞在mRNA和蛋白水平均有sTNFR1-IgGFc表達。Ad-sTNFR1-IgGFc轉(zhuǎn)染后氣道平滑肌細胞表達的TNFR1蛋

9、白分泌到培養(yǎng)上清中，表達高峰在轉(zhuǎn)染后48h，表達量為11.3ng/ml，表達持續(xù)至少1周以上，轉(zhuǎn)染上清稀釋64倍后仍對TNF有拮抗活性。轉(zhuǎn)染上清對TNF-α的促平滑肌細胞增殖作用起顯著抑制作用。 三、研究結(jié)論： 構(gòu)建的重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc可有效轉(zhuǎn)染人氣道上皮細胞及人氣道平滑肌細胞，并在其中高效表達，轉(zhuǎn)染細胞上清能拮抗TNF-α活性，同時可以抑制平滑肌細胞的增殖，為將表達sTNFR1-IgGFc腺病毒基

10、因治療哮喘的實驗研究提供了基礎(chǔ)。 第二部分：可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實驗研究 一、研究方法： 1、慢性哮喘小鼠模型建立24只4-6周SPF級BALB/c雌性小鼠，隨機分為生理鹽水霧化吸入組(A組)和哮喘模型組(B組)，Ad-GFP對照組(C組)，Ad-sTNFR1-IgGFc處理組(D組)，每組6只。制備慢性哮喘小鼠模型。哮喘模型組：首日致敏予腹腔內(nèi)，皮下注射10％OVA(卵蛋白)和10％氫氧

11、化鋁混合液1ml，第7日重復(fù)1次以加強致敏；2周后，將小鼠置入透明霧化吸入箱，予2.5％OVA霧化吸入(霧粒直徑3～5μm)，隔日1次，每次60min，連續(xù)4周。正常對照組：予等量生理鹽水腹腔注射以及生理鹽水霧化吸入，其余步驟同哮喘模型組。 2、Ad-sTNFR1-IgGFc腺病毒基因轉(zhuǎn)染小鼠，灌洗液收集及計數(shù)在誘導(dǎo)哮喘的第40天，A組不作任何治療，實驗組(D組)經(jīng)鼻滴入Ad-sTNFR1-IgGFc100μl(1×109TCI

12、D50)病毒，對照組(C組)經(jīng)鼻滴入Ad-GFP100μl(1×109TCID50)病毒。所有小鼠繼續(xù)霧化OVA1次/天，每次60分鐘，連續(xù)2天，第3日處死小鼠行灌洗液的收集、細胞涂片的制作、細胞計數(shù)和分類3、病理檢查及TNFRI在肺組織中表達檢測取小鼠右肺組織4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片、HE(蘇木素-伊紅)，AB/PAS(阿爾辛蘭-過碘酸雪夫)染色，光鏡下觀察細支氣管、肺組織病理變化。左肺組織采用RT-PCR檢測TNFR1-IgG

13、Fc的基因表達，免疫組化染色檢測TNFR1-Fc蛋白在肺組織中的表達，采用TNFR1原位雜交試劑盒檢測TNFRI表達二、研究結(jié)果：B、C、D三組細胞總數(shù)、中性粒細胞均顯著高于A組(P<0.01)。而D組細胞總數(shù)低于B組和C組(P<0.01)。B組和C組嗜酸性細胞(EOS)數(shù)量顯著高于D組(P<0.01)，表明經(jīng)鼻吸入Ad-TNFRI-IgGFc對BALF中EOS及炎性細胞浸潤有顯著抑制作用。病理切片提示基因治療組小鼠較哮喘模型組及Ad-

14、GFP對照組在支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織炎癥明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，氣管平滑肌細胞增生減少，管腔縮窄不明顯，肺泡間隔無明顯增寬。AB/PAS染色提示哮喘模型組小鼠氣道周圍上皮有杯狀細胞增生，呈紫紅色，基因轉(zhuǎn)染治療組小鼠氣道周圍上皮杯狀細胞增生明顯減少。Ad-GFP對照組與哮喘模型組在炎性細胞浸潤及平滑肌細胞增生等方面無明顯差異。 二、研究結(jié)果： B、C、D三組細胞總數(shù)、中性粒細胞均顯著高于A組(P<0.01)

15、。而D組細胞總數(shù)低于B組和C組(P<0.01)。B組和C組嗜酸性細胞(EOS)數(shù)量顯著高于D組(P<0.01)，表明經(jīng)鼻吸入Ad-TNFRI-IgGFc對BALF中EOS及炎性細胞浸潤有顯著抑制作用。病理切片提示基因治療組小鼠較哮喘模型組及Ad-GFP對照組在支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織炎癥明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，氣管平滑肌細胞增生減少，管腔縮窄不明顯，肺泡間隔無明顯增寬。AB/PAS染色提示哮喘模型組小鼠氣道周圍上皮有杯狀細

16、胞增生，呈紫紅色，基因轉(zhuǎn)染治療組小鼠氣道周圍上皮杯狀細胞增生明顯減少。Ad-GFP對照組與哮喘模型組在炎性細胞浸潤及平滑肌細胞增生等方面無明顯差異。 三、研究結(jié)論： 證實重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc可以經(jīng)鼻吸入高效轉(zhuǎn)染小鼠肺組織，經(jīng)免疫組化，原位雜交等方法證實其在氣道上皮及平滑肌細胞中高效表達sTNFR1-IgGFc。初步實驗證明通過轉(zhuǎn)染可溶性TNF受體基因治療可以抑制哮喘氣道炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生，同時