慢病毒介導(dǎo)的人可溶性腫瘤壞死因子受體1在未成熟樹突狀細胞的表達.pdf

1、目的: 構(gòu)建含有人可溶性腫瘤壞死因子受體1 (sTNFR1) 的慢病毒表達載體，觀察其在未成熟樹突狀細胞 (imDC) 中的表達，為進一步研究imDC在骨髓移植免疫耐受中的作用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1. 以人外周血單個核細胞總RNA為模板，RT-PCR擴增出sTNFR1基因片段，亞克隆至慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pXZ208，酶切并DNA測序驗證正確后，通過IRES連接EGFP報告基因，建立雙順反子慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名

2、為pXZ9-sTNFR1，DNA測序鑒定。采用陽離子脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒ΔNRF和包膜蛋白質(zhì)粒pVSVG共轉(zhuǎn)染293 FT細胞，根據(jù)報告基因EGFP測定病毒滴度，轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h收集病毒上清，獲得攜帶sTNFR1基因的重組慢病毒 pXZ9-sTNFR1。
　　 2. 分離、純化C57BL/6小鼠的骨髓單個核細胞，用含20 ng/mL重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子 (rmGM-CSF) 和1 ng/mL

3、重組小鼠白細胞介素-4 (rmIL-4) 的 RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d獲得imDC，用脂多糖 (LPS) 刺激后繼續(xù)培養(yǎng)2 d。光鏡下觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測細胞表型。用pXZ9-sTNFR1病毒上清感染imDC，同時以pXZ9病毒作為對照。48 h后流式細胞術(shù)評估感染效率。RT-PCR檢測感染后imDC中sTNFR1的轉(zhuǎn)錄，Western blot法檢測 sTNFR1蛋白在imDC細胞和培養(yǎng)上清中的表達。
　　

4、3. 觀察骨髓來源的DC成熟過程中的表型變化，以及sTNFR1基因修飾DC的表型特征。
　　 結(jié)果:
　　 1. 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒 pXZ9-sTNFR1，轉(zhuǎn)染293 FT細胞12 h后在熒光顯微鏡下觀察到EGFP表達，48 h、72 h 和96 h收集病毒上清，病毒滴度為106 U/L以上，獲得攜帶sTNFR1基因的重組慢病毒 pXZ9-sTNFR1。
　　 2. 流式細胞術(shù)檢測病毒上清對imDC感染效率達 (

5、61.37±5.48) ％。RT-PCR檢測到sTNFR1的表達，Western blot法檢測到sTNFR1蛋白存在于感染后imDC細胞的培養(yǎng)上清中，而對照組未檢測到sTNFR1的轉(zhuǎn)錄和表達。
　　 3. 小鼠骨髓單個核細胞在培養(yǎng)24 h 后大部分貼壁生長，僅見少量懸浮細胞，約4 d 左右出現(xiàn)半黏附細胞集落，集落逐漸增多、變大，6~7 d時細胞表面出現(xiàn)長短不一毛刺樣突起。第5 d的DC低表達CD40、CD86 、CD80分子，

6、幾乎不表達MHCⅡ類分子，第8 d時高水平表達MHCⅡ類分子和CD40、CD86 、CD80分子，顯示出成熟型DC的表型特征，在外源性LPS的刺激下，sTNFR1基因修飾可降低DC表面分子CD40、CD86 、CD80和MHCⅡ類分子的表達。
　　 結(jié)論:
　　 1. 成功構(gòu)建了負載sTNFR1基因片段及含EGFP報告基因的慢病毒載體，獲得了高滴度的重組慢病毒顆粒。
　　 2. 經(jīng)慢病毒高效轉(zhuǎn)導(dǎo)imDC后sTNF