燕窩糖蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

1、以燕窩中特有成分-燕窩糖蛋白為檢測(cè)目標(biāo)，建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)燕窩糖蛋白，為燕窩鑒偽提供有效方法。
　　 抗原是影響抗體特異性和效價(jià)的重要因素。燕窩經(jīng)60℃水浴提取、醇析得糖蛋白粗品，再經(jīng)DEAE-Sepharose fast flow離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析分離純化得到了成分相對(duì)均一的燕窩特征組分燕窩糖蛋白

2、，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定其分子量約為60 kD，且為單一條帶，再次說(shuō)明成分相對(duì)均一；通過(guò)β消去反應(yīng)，證明O型糖肽鍵的存在，證明所得組分為糖蛋白。
　　 以純化的糖蛋白免疫日本大耳白兔，獲得了兔抗燕窩糖蛋白抗血清，效價(jià)達(dá)到64000，采用Protein A-Sepharose4B親和層析純化的抗體作為第一抗體，其濃度為3.09mg/mL，以常用的辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗體

3、得到酶標(biāo)抗體，經(jīng)條件優(yōu)化建立了抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的雙抗夾心ELISA方法，其檢測(cè)限為0.031μg/mL，線性范圍為0.0625-2μg/mL。
　　 選用常見(jiàn)的燕窩摻假物銀耳、豬皮、淀粉、雞卵清蛋白以及凝集素、牛血清蛋白(BSA)等常見(jiàn)蛋白類物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果抗體和待測(cè)物的交叉反應(yīng)率很低，表明所建立方法特異性強(qiáng)。
　　 采用60℃水浴提取3-4 h，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并兩次提取液，過(guò)濾、離心。上清液經(jīng)PBS