骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死旁分泌效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、完成大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外培養(yǎng)、傳代，研究不同劑量的60Coγ射線對(duì)MSCs增殖的影響，觀察5-aza能否誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞及射線對(duì)其分化能力的影響。 2、建立大鼠急性心肌梗死(AMI)的模型，探討MSCs移植治療AMI的可行性，評(píng)價(jià)經(jīng)照射和未照射處理的MSCs移植后對(duì)大鼠心梗后心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的影響，并檢測(cè)MSCs移植后其分泌的細(xì)胞因子(VEGF，bFGF、IL-1β)

2、在心肌內(nèi)表達(dá)的變化。 3、研究體外培養(yǎng)的經(jīng)不同劑量射線照射的MSCs分泌細(xì)胞因子(VEGF、bFGF、IL-1β)的變化，評(píng)價(jià)心肌內(nèi)注射MSCs培養(yǎng)上清液，并定期給與腹腔內(nèi)注射后，對(duì)大鼠心梗后心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的影響，初步探討其作用機(jī)制。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、取凍存的第一代大鼠MSCs采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，取第3代MSCs行60Coγ射線照射(劑量為2Gy、4Gy、8Gy、12Gy)，結(jié)晶紫染色觀察

3、生長(zhǎng)情況和細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)4周后行臺(tái)盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)觀察MsCs的存活情況，MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)其增殖能力的變化。另取4Gy照射組及未照射組MSCs加入5-aza誘導(dǎo)分化4周，RT-PCR檢測(cè)C-TNT、β-MHC的表達(dá)。 2、50只大鼠隨機(jī)分為心梗對(duì)照組、MSCs移植組、照射MSCs(4Gy)移植組，術(shù)前超聲檢查心功能，采用開胸冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立AMI模型，心梗1h后分別注射兩種MSCs，同步記錄ECG變化。術(shù)后4周行超聲和血流動(dòng)

4、力學(xué)檢測(cè)心臟大小和心功能變化，RT-PCR檢測(cè)VEGF、bFGF、IL-1β在心肌內(nèi)的表達(dá)，心臟標(biāo)本行HE染色，并行Ⅷ因子免疫組化染色比較不同組微血管密度的差異。 3、收集各組MSCs照射前及照射后第一次換液的培養(yǎng)液，用ELISA法檢測(cè)各組上清液中VEGF、IL-1β、bFGF含量的變化。 4、30只大鼠隨機(jī)分為注射上清液組和培養(yǎng)基組，除了采用RT-PCR和ELISE兩種方法檢測(cè)VEGF、bFGF、IL-1β在心肌組織內(nèi)

5、的表達(dá)外，其他實(shí)驗(yàn)步驟、方法及檢測(cè)指標(biāo)同實(shí)驗(yàn)第二部分。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、未照射組、2Gy和4Gy組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，8Gy和12Gy組細(xì)胞全部死亡。2Gy組細(xì)胞增殖能力未受到影響，而4Gy組細(xì)胞增殖能力受到抑制，且持續(xù)3周以上。未照射組和4Gy照射組經(jīng)5-aza誘導(dǎo)，4周后未發(fā)現(xiàn)心肌樣細(xì)胞，未見細(xì)胞融合及肌管形成，但C-TNT和β-MHC在未照射組有所表達(dá)，而4Gy組無表達(dá)。 2、第二部分大鼠心梗模型成功率74％

6、，存活率66％。心臟超聲各項(xiàng)指標(biāo)(LVEF、LVDd、LVDs、FS)三組都明顯低于術(shù)前，兩細(xì)胞移植組較心梗對(duì)照組術(shù)后心功能明顯改善、心臟縮小。兩細(xì)胞移植組的各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmin明顯好于心梗對(duì)照組。兩細(xì)胞移植組三種細(xì)胞因子表達(dá)明顯增加，而對(duì)照組未檢測(cè)到。Ⅷ因子免疫組化染色微血管計(jì)數(shù)對(duì)照組明顯少于兩細(xì)胞移植組。 3、不同劑量照射后三種細(xì)胞因子表達(dá)同照射前相比都下降，且隨著照

7、射劑量的增加，細(xì)胞因子分泌量下降明顯。 4、第三部分心梗模型成功率83.3％，存活率73.3％。超聲和血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)上清液組各項(xiàng)指標(biāo)明顯好于培養(yǎng)基組。上清液組檢測(cè)心肌組織三種細(xì)胞因子表達(dá)增加，ELISA法能檢測(cè)到培養(yǎng)基組和心梗對(duì)照組三種細(xì)胞因子少量表達(dá)。Ⅷ因子免疫組化染色微血管計(jì)數(shù)值上清液組顯著高于培養(yǎng)基組。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、體外培養(yǎng)的MSCs對(duì)60Coγ射線比較敏感，輻射劑量達(dá)到一定程度(4Gy)后會(huì)影響M

8、SCs的活力和增殖能力，表現(xiàn)為其活力和增殖能力明顯受到抑制，8Gy以上大劑量照射后導(dǎo)致MSCs全部死亡。小劑量的60Coγ射線(4Gy)照射會(huì)抑制或損傷大鼠MSCs的分化能力，可能是損傷或者暫時(shí)抑制這種能力。 2、移植喪失分化能力的MSCs及正常MSCs都能明顯改善心梗后早期的心功能。MSCs移植后在心肌內(nèi)能表達(dá)多種細(xì)胞因子如(VEGF、bFGF和IL-1β)，單獨(dú)注射這些細(xì)胞因子同樣能夠改善心功能，可見MSCs移植能夠改善心梗