骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠心病(Coronaryheartdisease，CHD)是臨床最常見的心臟疾病之一，嚴(yán)重的可導(dǎo)致心功能衰竭，是一類嚴(yán)重危害人民健康的疾病，在我國(guó)心衰患者最重要的一個(gè)致病因素就是急性心肌梗死。其主要的病理生理過程為：冠狀動(dòng)脈狹窄，粥樣斑塊形成，心肌細(xì)胞缺血缺氧，變性壞死。由于成年心肌細(xì)胞缺乏再生修復(fù)能力，一旦壞死，細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量將減少，梗塞區(qū)心肌細(xì)胞將轉(zhuǎn)化為疤痕組織而失去功能，致使心功能難以恢復(fù)，最終導(dǎo)致死亡，這種不可逆轉(zhuǎn)的過程是治療中

2、最棘手的問題。 心肌細(xì)胞再生代替受損的心肌是一種前景非常好的治療方法，保護(hù)(增加)具有收縮功能的有效心肌細(xì)胞是治療各種心肌損傷最為合理的途徑，近年來，干細(xì)胞移植為心肌梗死的治療提供了一種新思路，受到了廣泛關(guān)注。目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)的分離、純化、鑒定及其多能誘導(dǎo)分化的研究已受到廣泛關(guān)注。MSCs不僅可以分化為同胚層的成體細(xì)胞，而且在特定情況下尚可跨胚層分化，因此，被認(rèn)為是最有

3、希望的工程細(xì)胞之一。 MSCs治療心肌梗塞目前有少數(shù)報(bào)道，多數(shù)人認(rèn)為，5～10天為移植較佳的時(shí)間點(diǎn)。但是，首先，這時(shí)的患者正處于疾病的危險(xiǎn)期，進(jìn)行移植手術(shù)存在很大的風(fēng)險(xiǎn)；其次，從細(xì)胞來源上，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)只能考慮庫(kù)存的異體MSCs移植，而從臨床應(yīng)用角度來說，自體的干細(xì)胞優(yōu)于胚胎干細(xì)胞及同種異體干細(xì)胞。 心肌梗塞患者在入院后，必須經(jīng)過一周左右的治療，病情才比較穩(wěn)定，能夠耐受骨髓的抽取，一個(gè)月左右基本上能度過危險(xiǎn)期，而在這段時(shí)

4、間內(nèi)，也能從技術(shù)上完成MSCs分離、培養(yǎng)或誘導(dǎo)分化，并獲取足夠數(shù)量、純度及生長(zhǎng)力的自體MSCs用于移植。所以我們研究的重點(diǎn)，是探討自體移植的MSCs在發(fā)病一個(gè)月后的梗死的心肌中存活和分化為心肌樣細(xì)胞的情況。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下： 以新西蘭大白兔為對(duì)象，研究MSCs自體移植治療心肌梗死的前景，包括以下兩個(gè)方面的內(nèi)容：一、MSCs的體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和分化；二、誘導(dǎo)及非誘導(dǎo)的MSCs自體移植對(duì)心肌梗死后新西蘭大白兔心功能的影響。 第

5、一部分兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的 對(duì)MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，了解其生長(zhǎng)、增殖特性，以及5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)誘導(dǎo)MSCs的最適誘導(dǎo)濃度。 方法 取新西蘭大白兔脛骨骨髓，反復(fù)吹打混勻后制成骨髓細(xì)胞單細(xì)胞懸液。利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(1.077g·ml-1)進(jìn)行梯度密度離心，分離獲取MSCs，經(jīng)含10％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并差異貼壁純化后傳代。流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)生長(zhǎng)良好的第二代培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記CD29、CD34、CD45，鑒定我們培養(yǎng)的細(xì)胞是否為MSCs。 調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，將細(xì)胞分為6組。按照5-aza誘導(dǎo)分化劑量分5個(gè)組，培養(yǎng)基中分別加入3、6、10、20、30(μmol·ml-1)5-aza，與細(xì)胞共孵育24h，然后更換成DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)生長(zhǎng)10天并獲取細(xì)胞，通過倒置顯微鏡、透射電鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)等方法，了解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的變化。另外一組為正常對(duì)照組。

7、 結(jié)果 接種的MSCs24h后開始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞；48h后細(xì)胞出現(xiàn)突起，并轉(zhuǎn)變成多角形、梭形；72h左右貼壁鋪伸細(xì)胞數(shù)明顯增加，突起變長(zhǎng)，體積增大，細(xì)胞表現(xiàn)為紡錘形、梭形、多角形，并呈集落形分布，彼此不相接觸；第4d開始，形成均勻分布的簇狀增生灶，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，緊密排列；第5d后，細(xì)胞迅速增殖，簇狀增生灶的數(shù)量及面積不斷擴(kuò)大，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，并開始出現(xiàn)一定的方向性；10d以后，90％以上細(xì)胞融合，形態(tài)均為梭形，緊密排列呈旋渦狀生長(zhǎng)。未

8、貼壁的細(xì)胞經(jīng)反復(fù)換液基本已被清除。傳代后的MSCs呈均勻分布的平均生長(zhǎng)，第三代以后開始呈比較均一的成纖維狀，并達(dá)到了移植的要求。 通過流式細(xì)胞儀對(duì)第二代培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD45的檢測(cè)，結(jié)果顯示：CD29表達(dá)陽(yáng)性(陽(yáng)性細(xì)胞比率為87.6％)，CD34表達(dá)陰性(陽(yáng)性細(xì)胞比率為5.3％)，CD45表達(dá)陰性(陽(yáng)性細(xì)胞比率為2.4％)，證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。不同濃度的5-aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下

9、可見細(xì)胞體積增大、形態(tài)延長(zhǎng)，并形成肌管狀結(jié)構(gòu)，呈走行一致的束狀排列；在透射電鏡下可以觀察到部分MSCs內(nèi)有明顯的肌絲形成，而且，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)肌絲的含量隨著藥物濃度增加而增加，其中10μmol/L-1濃度的5-aza是能使大多數(shù)細(xì)胞向肌源性細(xì)胞分化的最小濃度；免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見經(jīng)誘導(dǎo)后的這些細(xì)胞能與抗肌紅蛋白抗體發(fā)生反應(yīng)，DAB顯色，胞漿被染成棕紅色，而未誘導(dǎo)的細(xì)胞未著色。 結(jié)論：(1)通過梯度密度離心及差異貼壁相結(jié)

10、合的方法，可以得到純度較高的可供移植的MSCs。(2)MSCs可在體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)化為肌源性細(xì)胞。(3)5-aza對(duì)MSCs的最適誘導(dǎo)濃度是10μmol·L-1。 第二部分兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究 目的 研究自體移植誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的MSCs對(duì)兔心肌梗死模型心功能的影響及差別。 方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組：1、正常對(duì)照組(假手術(shù)組)，2、心梗模型組，3、MSCs細(xì)胞(未誘導(dǎo)MSC

11、s)移植組，4、肌源細(xì)胞(誘導(dǎo)后MSCs)移植組，5、培養(yǎng)基對(duì)照組。 采取結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的辦法建立兔心肌梗塞模型。心梗模型建立一周后，取3、4、5組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脛骨骨髓，經(jīng)梯度密度離心及差異貼壁純化后得到MSCs并進(jìn)行傳代，傳代至第二代時(shí)，將第4組給予10μmol·L-1濃度的5-aza誘導(dǎo)24h，然后更換成DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。MSCs在體外傳代培養(yǎng)到第四代，于移植前24h，BrdU分別標(biāo)記3、4組的MSCs，第二天

12、分別將自體MSCs細(xì)胞懸液分4點(diǎn)注射到心肌梗死兔左室前壁，第5組注射等體積不含血清的DMEM培養(yǎng)液，第1組只開胸不注射。 手術(shù)前后、細(xì)胞移植4周后，彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組動(dòng)物左室射血分?jǐn)?shù)、左室側(cè)壁運(yùn)動(dòng)幅度及左室收縮期室壁增厚率，血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)左心室最大壓力上升速率(dp/dt)，分別評(píng)價(jià)移植前后心肌梗塞模型兔的心功能，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 所有檢測(cè)指標(biāo)完成后，取左心室組織切片，連續(xù)2張為一組：第一張5-溴尿嘧啶脫氧核

13、苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)抗體免疫組化染色，第二張肌鈣蛋白Ⅰ(TroponinⅠ，TnⅠ)抗體免疫組化染色。觀察移植細(xì)胞的成活和分化狀況。 結(jié)果 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后，心電圖檢查可見V1、V3、V5導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高，證明建立的心梗模型是成功的。 細(xì)胞移植4周后，經(jīng)彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組動(dòng)物左室射血分?jǐn)?shù)、左室側(cè)壁運(yùn)動(dòng)幅度及左室收縮期室壁增厚率，經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)左心室最大壓力上升速率(dp

14、/dt)，所得結(jié)果顯示：MSCs細(xì)胞移植組、肌源細(xì)胞移植組的心功能與心梗組、培養(yǎng)基對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)；與正常組(假手術(shù)組)相比仍有差異(P＜0.05)；MSCs細(xì)胞移植組與肌源細(xì)胞移植組相比無顯著差異(P＞0.05)，培養(yǎng)基對(duì)照組與心梗組相比無顯著差異(P＞0.05)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)與血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)所得出的結(jié)果基本相似。 梗死區(qū)注射經(jīng)BrdU標(biāo)記的誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)MSCs后，免疫組化染色顯示，心梗區(qū)內(nèi)有部分細(xì)胞核