柑橘綠霉病菌高效基因敲除體系構(gòu)建與C-5甾醇去飽和酶基因功能研究.pdf

1、由柑橘綠霉病菌(Penicillium digitatum)引起的柑橘綠霉病是采后柑橘腐爛的重要因子，造成的采后損失約占全部損失的90％，然而對(duì)該病菌的致病、抗藥的分子機(jī)制知之甚少。對(duì)感興趣的基因進(jìn)行敲除是研究該基因功能的必要途徑。雖然我們已建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘綠霉病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，但應(yīng)用該體系敲除基因的頻率低下，對(duì)有些基因甚至無(wú)法實(shí)現(xiàn)敲除，以致該病菌基因功能研究的進(jìn)程緩慢。
　　本論文報(bào)道了:1.一種高效的柑橘綠霉病菌基因敲除體

2、系的構(gòu)建;2.柑橘綠霉病菌C-5甾醇去飽和酶基因PdErg3B的功能，結(jié)果如下:
　　1.一種高效的柑橘綠霉病菌基因敲除體系的構(gòu)建
　　低效率的基因敲除與絲狀真菌存在活躍的非同源末端鏈接(Non-homologous end joining，NHEJ)的DNA雙鏈新裂（DNA double-strandbreaks，DBSs）修復(fù)途徑有關(guān)，而蛋白Ku70和Ku80構(gòu)成的異聚體是NHEJ途徑的關(guān)鍵因子。本研究應(yīng)用米曲霉(Asp

3、ergillus oryzae)的Ku80同源基因AoKu80到本實(shí)驗(yàn)室完成測(cè)序的柑橘綠霉病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源搜索，比對(duì)發(fā)現(xiàn)該病菌存在一個(gè)Ku80同源基因，命名為PdKu80。PdKu80基因全長(zhǎng)2673 bp，含10個(gè)內(nèi)含子，編碼712個(gè)氨基酸。通過(guò)兩步PCR和基因克隆技術(shù)將潮霉素抗性基因元件替換PdKu80基因編碼序列，構(gòu)建PdKu80缺失的質(zhì)粒pTFCM-△PdKu80，再在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下將pTFCM-△PdKu80導(dǎo)入柑橘綠

4、霉病菌的基因組，在含潮霉素培養(yǎng)基上篩選出82個(gè)轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR和Southern blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)轉(zhuǎn)化子為PdKu80缺失，且無(wú)pTFCM-△PdKu80隨機(jī)插入的突變體（△PdKu80）。表性分析表明△PdKu80的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和致病力與野生型菌株基本一致。
　　以同樣的方法構(gòu)建PdBrlA缺失的質(zhì)粒pNEO1300-△PdBrlA，PdMpkA缺失的質(zhì)粒pNEO1300-△PdMpkA，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下分別將這兩個(gè)質(zhì)

5、粒轉(zhuǎn)化野生型菌株P(guān)dKH8和△PdKu80，在含新霉素培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定確定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以PdKH8為受體菌株時(shí)，PdBrlA和PdMpkA的敲除頻率分別為2.2％和4.0％，而以△PdKu80為受體菌株時(shí)，PdBrlA和PdMpkA的敲除頻率分別為33.3％和13.0％?？梢?jiàn)使用△PdKu80為受體菌株，可提高柑橘綠霉病菌的基因敲除頻率。
　　2.PdErg3B基因功能研究
　　柑橘綠霉病菌中存在兩個(gè)煙曲

6、霉C-5甾醇去飽和酶基因PdErg3A、PdErg3B。PdErg3A基因全長(zhǎng)939 bp，編碼312個(gè)氨基酸，不含內(nèi)含子;PdErg3B基因全長(zhǎng)1130 bp，編碼350個(gè)氨基酸，在nt271與nt347之間存在一個(gè)長(zhǎng)為77 bp的內(nèi)含子。通過(guò)缺失PdErg3B不影響柑橘綠霉病菌的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和麥角甾醇的合成，但提高了病菌對(duì)抑霉唑、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇等DMI類殺菌劑的抗性。可見(jiàn)PdErg3B與柑橘綠霉病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和麥角甾醇合