蘋果幾丁質(zhì)酶基因功能驗(yàn)證.pdf

1、幾丁質(zhì)酶可以降解真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長，許多轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的植物也表現(xiàn)出對(duì)某些真菌病害的抗性，因此幾丁質(zhì)酶基因在植物轉(zhuǎn)基因抗病育種中具有重要的研究價(jià)值。
　　由褐斑病菌(Marssonina coronaria)引起的蘋果早期落葉病是導(dǎo)致落葉程度較重的真菌病害。該病害通常在雨后及濕度較大的6至7月發(fā)生，它在東亞（包括中國和日本）給蘋果產(chǎn)量造成了很嚴(yán)重的損失。培育抗性品種是解決該問題最經(jīng)濟(jì)有效的手段。

2、　　本研究從‘富士’葉片中克隆MdChi基因，構(gòu)建真核及植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母及煙草中，研究MdChi基因的表達(dá)狀況并探討該基因在抗真菌病害中的可能作用，為以后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用該基因提高果樹抗病性提供依據(jù)。同時(shí)利用褐斑病菌孢子懸浮液侵染蘋果品種‘富士’、‘秦冠’及其雜交后代‘FQ-2’葉片，在侵染后0h、24h、48h、72h、96h分別取樣，對(duì)蘋果幾丁質(zhì)酶基因MdChi在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況進(jìn)行分析。
　　獲得的主要結(jié)

3、果如下：
　　1.構(gòu)建了MdChi基因的真核表達(dá)載體pPIC9K-MdChi，并將其導(dǎo)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115，用甲醇成功誘導(dǎo)表達(dá)了MdChi蛋白。SDS-PAGE分析表明，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白大小為34KDa，與預(yù)期蛋白大小相符。
　　2.構(gòu)建了植物表達(dá)載體PBI121-MdChi，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將PBI121-GUS、PBI121-MdChi導(dǎo)入煙草，經(jīng)過Km篩選和PCR檢測(cè)分別獲得5株和8株轉(zhuǎn)化子。RT-P

4、CR分析表明，轉(zhuǎn)MdChi基因的煙草植株均檢測(cè)到MdChi基因的表達(dá)，且表達(dá)量有所不同。而未轉(zhuǎn)化株及轉(zhuǎn)GUS基因的煙草均未檢測(cè)到MdChi基因的表達(dá)。接種鑒定，結(jié)果表明，有2株（C1、C3）表現(xiàn)出對(duì)煙草赤星病的抗性提高。
　　3.褐斑病菌誘導(dǎo)下MdChi在3份蘋果種質(zhì)的葉片中均有表達(dá)，感病品種‘富士’葉片中MdChi基因表達(dá)量明顯高于抗病品種‘秦冠’及兩者雜交后代‘FQ-2’。其中，侵染后24h時(shí)‘富士’葉片中的表達(dá)量明顯上升，4