博士專題：基因功能研究技術(shù)之基因敲除及基因編輯技術(shù)

1、博士專題：基因功能研究技術(shù)之 ——基因敲除、基因編輯技術(shù),劉惠榮內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失,基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重組，能夠使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效

2、率特別低（低于10-6），增加了實際操作的工作量，限制了該項技術(shù)的應(yīng)用。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術(shù)得到進一步的發(fā)展和完善，目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。,,基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除、條件型基因敲除、誘導(dǎo)型基因敲除。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或動物個體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基

3、因敲除。誘導(dǎo)型基因敲除是通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制，在動物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實現(xiàn)對特定基因進行敲除的技術(shù)。,基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設(shè)計為替換型載體。,（一）完全基因敲除,基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后會引起胚

4、胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。,（二）條件型基因敲除,條件型基因敲除法可定義為將某個基因的敲除限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。該系統(tǒng)在80年代被引入后，已成功被應(yīng)用于酵母菌、植物、哺乳動物細(xì)胞及小鼠身上?，F(xiàn)階段條

5、件型基因敲除以噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)和釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是條件型基因打靶、誘導(dǎo)型基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λ Int酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號X03453），編碼38kDa蛋

6、白質(zhì)。Cre 重組酶是一種由 343 個氨基酸組成的單體蛋白。它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的 DNA 序列，即 loxP 位點，使 loxP位點間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的 DNA 底物，如線形、環(huán)狀甚至超螺旋 DNA。,Cre-LoxP重組酶系統(tǒng),LoxP（locus ofX-overP1）序列：來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復(fù)序列和中間

7、間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下 ：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5',,Cre-LoxP系統(tǒng)的

8、特性,,,條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。,,,,,Cre/loxP系統(tǒng)作用原理示意圖,FLP／FRT 系統(tǒng),該系統(tǒng)與Cre／loxP系統(tǒng)相同，也是由一個重組酶 和一段特殊

9、的DNA序列組成。從進化的角度上考慮，F(xiàn)lp／FRT系統(tǒng)是Cre／loxP系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中，重組酶Flp是酵母細(xì)胞內(nèi)的一個由423個氨基酸組成的單體蛋白。與Cre相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)的另一個成分Flp識別位點(Flp recognition target，F(xiàn)RT)與loxP位點非常相似，同樣由兩個長度為13bp的反向重復(fù)序列和一個長度為8 bp的核心序列構(gòu)成

10、。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時，F(xiàn)RT位點的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。這兩個系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同，Cre重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為37℃，而Flp重組酶為30℃。因此，Cre／loxP系統(tǒng)最適宜在動物體內(nèi)使用。loxP和FRT位點的序列如圖所示,,,這一技術(shù)亦存在一些缺點：費用太高周期較長許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這些基因的功能為其他基因代償所致,條件型基因打靶的優(yōu)勢：克服了重要基因被

11、敲除所導(dǎo)致的早期致死并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及疾病發(fā)生、治療過程中的作用和機制,（三）誘導(dǎo)型基因敲除,誘導(dǎo)型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用控制Cre表達(dá)的啟動子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制從而在動物的一定發(fā)育階段和組織細(xì)胞中實現(xiàn)對特定基因的敲除。,由Cre/Loxp系統(tǒng)和誘導(dǎo)系統(tǒng)兩個部分組成。Loxp轉(zhuǎn)基因動物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的，基因組中待

12、修飾區(qū)域兩端各攜帶1個Loxp位點的轉(zhuǎn)基因動物。誘導(dǎo)系統(tǒng)是指所攜帶的Cre基因的表達(dá)或所表達(dá)的Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)基因動物。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計來對動物基因敲除的時空特異性進行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)型基因敲除類型有：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。,III、基因編輯技術(shù),ZFN系統(tǒng)TALEN系統(tǒng)CRISPR/Cas 系統(tǒng),（一）ZFN技

13、術(shù)系統(tǒng),ZFN 技術(shù)原理,鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。,鋅指結(jié)構(gòu)中每一個α螺旋可以特異識別3-4個堿基；人工設(shè)計識別特異DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個X來實現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷D

14、NA雙鏈。,,單個ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含3-6個Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域，每個鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識別1個三聯(lián)體堿基，與鋅指蛋白相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的C端96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個ZFN，識別特定的位點，但2個識別位點相距6-8bp距離時，2個單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點產(chǎn)生1個DNA雙鏈切口，然后利用固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機制

15、進行切口修復(fù)。從而達(dá)到對精確位點進行定點修飾的目的。,ZFN 技術(shù),鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除,研究人員可以利用ZFN技術(shù)進行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。,,ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于黑長尾猴、大鼠、小鼠、中國倉鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、豬、牛、人類iPS細(xì)胞等，此外，該技術(shù)已經(jīng)有用于治療HIV的ZFN藥物進入二期臨床

16、實驗。但是，該技術(shù)制備復(fù)雜，成本昂貴，而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。,（二）,嶄新的技術(shù) - TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn) – 染色體DNA序列的人工編輯修改 （點）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，Knockout） 片段刪除 片段插入目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療,嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn),靶向基因技術(shù),經(jīng)典方法 ：自殺質(zhì)粒，同源重組

17、– 幾率低(~1 HR event per 106 cells），難！飽含希望與失望的技術(shù)：ZFN，被Sigma公司壟斷新的里程碑：TALEN,TALEN技術(shù),基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶)的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象。技術(shù)原理：表達(dá)一個

18、重組核酸酶，在靶點識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識別靶點核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過程。,1989年 植物病原體黃單胞菌屬 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。2007年 發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性， avrBs3 – TA2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列與核酸靶序列的對應(yīng)關(guān)系被破譯 由34個aa組成一個單元模塊，重復(fù)

19、17 -18次 34個aa中的第12和13個氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 對應(yīng)識別一個目標(biāo)堿基,TALEN 發(fā)展過程,人工構(gòu)建TALE模塊識別指定核酸序列,,,,,102堿基模塊單元,…… 14 – 18個重復(fù),,,,,真核表達(dá),,,,,,特異識別指定的14 -18 個核酸序列并與之結(jié)合,34氨基酸單元,,,,,TALEN 發(fā)展過程,TALEN (TALE+FOK I) 表達(dá)質(zhì)粒對,TALE

20、N 基因敲除,X 2,TALEN 表達(dá)質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染、表達(dá)切割靶位點,切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體,TALEN介導(dǎo)的同源重組,同源重組發(fā)生率升高幾個數(shù)量級,HR,,Left arm,Right arm,Left arm,Right arm,,點突變,,,,片段刪除,基因敲入,2011

21、年8月， Nature Biotechnology 上同時發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一篇人類干細(xì)胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 一篇大鼠《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》 兩篇斑馬

22、魚 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》 《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 一篇綜述《Move over ZFN》,TALEN的最前沿,TALEN靶向（基因敲除）技術(shù)基本流程,選擇、確定靶點2. TALE識別模塊

23、串聯(lián)構(gòu)建3. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建4. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá)TALEN重組蛋白5. 檢測突變效率，篩選（移碼）突變體,,,X 2,X 2,,,X 2,,,,,,,,,,,靶點的DNA序列特征：相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點參考文獻(xiàn)：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and o

24、ther TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在線靶點選擇設(shè)計軟件：https://boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/,選擇確定TALE靶點,TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、

25、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點），只須按照靶點序列將相應(yīng)TAL單元（14 -18個）串聯(lián)克隆即可。,TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建,,,具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),步驟一：靶點識別單元串聯(lián),步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建,具專利保護的克隆構(gòu)建系統(tǒng),將靶點識別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對靶點識別

26、模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個堿基）分別進行TAL識別模塊構(gòu)建。,X 2,真核表達(dá)TALEN質(zhì)粒對,步驟三. 將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后

27、，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點并與靶位點特異結(jié)合。此時，兩個TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標(biāo)基因。,FOKI 內(nèi)切酶打斷靶點區(qū),內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯誤的個體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。,突變體形成,PCR – 酶切法

28、利用靶點設(shè)計時挑選的，位于相鄰靶位點之間的特異性內(nèi)切酶位點，進行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 當(dāng)左右靶點之間沒有合適的酶切位點時可使用CEL-I核酸酶檢測。 經(jīng)驗規(guī)律：>= 2%可用，>=10%很好,,TALEN切割效率檢測,TALEN切割效率檢測,啟動子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK,啟動子 – ABCDEFHIJK,共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒 1+

29、TALEN質(zhì)粒 2,熒光素酶檢測法,發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)1.5至2倍即可有效獲得突變體。,突變體篩選,有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PCR測序確認(rèn),基本工具質(zhì)粒,14 – 18bp靶點序列,怎樣做TALEN,1單元模塊質(zhì)粒：A，G，C, T共4種2單元模塊質(zhì)粒：4X4=16種TALEN表達(dá)載體：基于PCS2質(zhì)粒2種,怎樣做TALEN,怎樣做TALEN,TAL

30、EN技術(shù)成功率影響因素,重組TALEN模塊與靶位點的 ‘親合力’靶點序列設(shè)計原則來自20個天然TLAE的統(tǒng)計規(guī)律細(xì)胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困難細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率不同，293高， HeLa低所期待的目標(biāo)Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？Selection marker insertion？,TALE技術(shù)應(yīng)用范圍,細(xì)菌：尚無報道，已另有

31、多種高效靶向技術(shù)。真菌：有報道，TALE原理可行。植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。動物細(xì)胞：TALE原理可行，各細(xì)胞系效率不一。斑馬魚：有TALEN基因敲除報道，尚無點突變與敲入報道。小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚無報道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建實驗周期較長）。TALEN應(yīng)用擴展的技術(shù)關(guān)鍵：切實可靠的表達(dá)系統(tǒng)。高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。,TALEN的植物應(yīng)用,Ting Li et. al. High

32、-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology 背景水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)導(dǎo)致細(xì)菌性白葉枯病。細(xì)菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 與水稻Os11N3基因 啟動子結(jié)合，

33、調(diào)控（hijack）此基因上調(diào)表達(dá)，促進細(xì)胞內(nèi)糖份向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運，便于病原菌利用。 策略以TALEN對細(xì)菌TALE靶點區(qū)做突變，使細(xì)菌TALE無法與水稻Os11N3基因 啟動子結(jié)合。 結(jié)果突變水稻獲得抵御細(xì)菌感染的能力,TALEN與主要類同技術(shù)比較,siRNA優(yōu)于TALEN可瞬時轉(zhuǎn)染快速觀察效果Knockdown效果確實，可用于必須基因遜于TALEN瞬時轉(zhuǎn)染效果短暫不是徹底knockout慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨

34、機整合ZFN優(yōu)于TALEN經(jīng)驗積累多，技術(shù)較成熟遜于TALEN技術(shù)復(fù)雜，難度高，被Sigma公司壟斷靶點序列要求高，難找Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性,基因組精密工程,今年來自梅奧醫(yī)學(xué)中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它們，對斑馬魚基因組部分序列進行了定制修改。這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-lik

35、e effector nucleases ，TALENs）方法，相比ZFNs和 morpholinos，TALENs具有幾個優(yōu)勢：它們更便宜、更有效，尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效應(yīng)是短暫的，而TALENs可造成永久性的改變。隨后科學(xué)家們在蟾蜍等其它動物中展開了這方面的研究，證明這種技術(shù)與已證實的基因靶向技術(shù)一樣有效。國內(nèi)清華大學(xué)的施一公

36、和顏寧等人也于今年在Science雜志上報道了TALE特異識別DNA的分子機理，這提供了TALE蛋白的改造基礎(chǔ)，極大地拓寬了TALE蛋白在生物技術(shù)應(yīng)用上的前景。,,2012年，TALEN被《科學(xué)》雜質(zhì)評為十大科學(xué)突破之一。,新技術(shù)介紹,（三）CRISPR-Cas系統(tǒng)基因修飾技術(shù)Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associa

37、ted (Cas)9,Biotechnology: Rewriting a genomeNature 495, 50–51 (07 March 2013) doi:10.1038/495050a,1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：,1987年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對E.coli K12編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)

38、在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。2002年，科學(xué)家將其正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。隨著基因組測序，發(fā)現(xiàn)90%的古細(xì)菌、40%的細(xì)菌基因組中含有CRISPR位點。有的甚至含有2-3個位點。2013以后，研究者們在包括《

39、science》和《nature biotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。,CRISPR-Cas主要由兩部分組成：,,,,識別,切割,2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成：,CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進行特異性的識別，利用Cas蛋白進行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。,2.1 CRISPR

40、位點的結(jié)構(gòu),CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族, 廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點由一個前導(dǎo)區(qū)（leader）、多個高度保守的重復(fù)序列（repeat）和多個間隔區(qū)（spacer）組成，重復(fù)序列的長度通常 21~48 bp, 間隔序列26~72 bp

41、(spacer) 。重復(fù)序列具有二重對稱性，部分間區(qū)序列與某些已知的質(zhì)粒、噬菌體序列相匹配。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進行識別。,2.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,,根據(jù)Cas 基因核心元件序列的不同

42、, CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)被分為3 種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)需要多個Cas 蛋白形成復(fù)合體切割DNA 雙鏈, 而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9 蛋白來切割DNA 雙鏈,目前Ⅱ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。,CRISPR/Cas 的基因座結(jié)構(gòu)相對簡單。以產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型TypeⅡ CRISPR/Cas

43、 為例，其基因座結(jié)構(gòu)可分別三部分，5’ 端為tracrRNA 基因，中間為一系列Cas蛋白編碼基因， 包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3’ 端為CRISPR 基因座，由啟動子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(direct repeats)順序排列組成。,,,,3. TypeⅡ CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機理,,crRNAs：CRISPR 位點的第一個重復(fù)序列上游有CRISPR 前導(dǎo)序列(Lea

44、der sequence),該前導(dǎo)序列可以作為啟動子, 啟動CRISPR 序列的轉(zhuǎn)錄。多個研究表明CRISPR 基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小RNA 即為成熟crRNA，由一個間隔序列和部分重復(fù)序列組成，被命名為CRISPRRNAs(crRNAs), 這些crRNA和Cas 蛋白共同參與 CRISPR 免疫防御過程 。,,t

45、racrRNA：他們發(fā)現(xiàn)tracrRNA (trans-activating crRNA)對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA 的5’ 端與成熟的crRNA 3’ 端有部分序列(約13 bp)能夠配對進而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對維持crRNA 與靶點的配對可能十分重要。其指導(dǎo)RNaseⅢ和Cas9 完成前體crRNA 的成熟，隨后tracrRNA 還能與成熟的crRNA 的重復(fù)序列配對形成RNA 二聚體，進而和Cas9 蛋白結(jié)合成核糖

46、核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識別和降解入侵的外源DNA 功能。根據(jù)tracrRNA 與crRNA 的結(jié)構(gòu)特性，他們將tracrRNA 和crRNA 表達(dá)為一條嵌合的向?qū)NA(guide RNA， gRNA)， 并在體外證明gRNA 可以發(fā)揮tracrRNA 和crRNA 的功能，在目的基因處切割,形成DSBs, 該過程是CRISPR/Cas 對基因組進行編輯的基礎(chǔ)。,,,,Cas9：體外實驗證明Cas9 基因是參與CRISPR 免疫系統(tǒng)的唯

47、一必需基因, Cas9 是由1 409 個氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白, 含有2 個核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端的RuvC-like 結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域, HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與crRNA 互補配對的模板鏈, 切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt 處,RuvC-like 結(jié)構(gòu)域可以對另一條鏈進行切割, 切割位點位于PAM 上游3~8nt 處。

48、在crRNA 與tracrRNA 形成的雙鏈RNA 的指導(dǎo)下, Cas9 蛋白對靶位點進行切割。此外，他們還證明，將RuvC 或是HNH 活性突變后Cas9 只有單鏈切割活性，類似于切口酶。,到目前為止, 雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)的詳細(xì)作用機制尚未完全闡明, 但已基本明確了該作用機制的整個過程, 該過程大體分為3 個階段：1. 在噬菌體入侵的起始階段, Cas 蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列(protospa

49、cer), protospacer接下來整合到宿主基因組的CRISPR 位點的5′端;2. 然后這些短的摻入的protospacer 被轉(zhuǎn)錄成crRNA;3. 最后階段是在Cas 蛋白復(fù)合物的參與下, 靶向和干擾侵入的噬菌體DNA 序列。當(dāng)同種噬菌體再次入侵時, CRISPR的repeats 序列截取和保留的入侵噬菌體的某些DNA 片段形成spacers, spacers 會轉(zhuǎn)錄形成一些小的crRNA, 這些crRNA 會與tra

50、ns-activatingcrRNA(tracrRNA)形成一種雙鏈二級結(jié)構(gòu), 以此招募Cas 蛋白, crRNA、tracrRNA 以及Cas 蛋白形成復(fù)合體, 識別緊隨protospacer 序列后的PAM 序列,Cas 蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εccrRNA 互補的雙鏈DNA 進行切割, 從而使細(xì)菌具有對抗同類噬菌體再次入侵的能力。CRISPR 基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低，當(dāng)外源的質(zhì)?；蚴鞘删w入侵宿主菌時CRISPR

51、 的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)。,,,,,噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常protospacer 的5’或是3’ 端延伸幾個堿基序列很保守， 被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)，它的長度一般為2～5堿基，一般與protospacer 相隔1～4 堿基。新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識別入侵的核酸和掃描外源DNA 潛在的PAM，將臨近PAM 的序列作為候選proto

52、spacer；然后在CRISPR 基因座的5’端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個重復(fù)序列之間。,,,4. CRISPR/Cas 系統(tǒng)的應(yīng)用,CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與Cas 蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識別靶序列上的PAM 以及protospacer 。根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)這一特性，將其用于設(shè)計人工的核酸內(nèi)切酶(engineered endo

53、nuclease，EEN)，用來對我們感興趣的基因位點進行修飾．三類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中TypeⅡ型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對簡單，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一個蛋白．目前，產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的TypeⅡ型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾。,,,4.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求,最主

54、要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為NGG。,,在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個NGG PAM。,4.2 Cas介導(dǎo)編輯模板替換,2013年1月29日在《nature biotechnology》上發(fā)表的《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設(shè)計好的DNA

55、模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向修飾。,4.3 Cas介導(dǎo)基因修飾,2013年1月29日在《nature biotechnology》上發(fā)表的《efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾。,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在《science》上發(fā)表的

56、《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的spacers的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因進行編輯。,4.4 Cas介導(dǎo)雙基因修飾,5 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析,這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)。,2013年4月12日在《cell stem cell》上發(fā)表的《Enhanced Effici

57、ency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對同一基因進行修飾，效率分別為0%-34%和51%-79%。,而且從實際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就

58、行。,只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥?？梢詫θ魏魏竺婢o隨NGG(PAM)的20 bp 的序列進行編輯; 能同時作用于多個靶位點；,技術(shù)優(yōu)勢,,CRISPRdb 和CRISPI 是兩個專門收錄CRISPR信息的數(shù)據(jù)庫，CRISPRd

59、b 中包括一些識別和分析CRSPR 的軟件工具，數(shù)據(jù)庫由巴黎大學(xué)維護(http：//crispr.upsud.fr) [21-22]．CRSPI 中含有Cas 蛋白和CRISPRs 的數(shù)據(jù)，補充了CPRISPRdb 的數(shù)據(jù)(http：//crispi.geneouest.org/)．,三、隨機突變篩選策略,利用轉(zhuǎn)基因、基因敲除等技術(shù)從特定基因的改造到整體動物表型分析的“反向遺傳學(xué)”研究大大推動了功能基因組學(xué)的進展，但是也存在明顯

60、的局限性： 首先，由于生物體的代償機制，使得基因敲除動物常常觀察不到異常表型； 其次，由于“反向遺傳學(xué)”只能對已知的基因進行研究，而人類基因組中尚有90%以上的非編碼序列處于未知狀態(tài)； 第三，由于“功能缺失”和“功能獲得”小鼠常出現(xiàn)胚胎期死亡，而目前可用于條件性基因改造的啟動子還很少，從而阻礙了特定基因在成體動物中的功能分析； 第四，由于一個蛋白有多個不同的功能域，特定基因在不同位點上的突變可能產(chǎn)生不同的

61、表型，應(yīng)用單一的“功能缺失”方法，顯然不可能發(fā)現(xiàn)這些不同的異常表型。,因此，單單應(yīng)用“反向遺傳學(xué)”不足以完成功能基因組學(xué)的任務(wù)，而基于“正向遺傳學(xué)”的，從異常表型到特定基因突變的隨機突變篩選策略逐漸受到青睞。,隨機突變篩選策略的第一步是通過物理誘變、化學(xué)誘變或生物技術(shù)產(chǎn)生大量的基因組DNA突變。,基因捕獲(gene trapping)技術(shù)是一種產(chǎn)生大規(guī)模隨機插入突變的便利手段，對于揭示基因序列所對應(yīng)的基因功能具有重要的應(yīng)用價值。

62、 基因捕獲技術(shù)的基本過程是：將一含報告基因的DNA載體隨機插入基因組，產(chǎn)生內(nèi)源基因失活突變，通過報告基因的表達(dá)，提示插入突變的存在，以及內(nèi)源基因的表達(dá)特點。利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細(xì)胞庫, 每一種ES細(xì)胞克隆中含有不同的突變基因，ES細(xì)胞克隆經(jīng)囊胚注射發(fā)育為基因突變動物模型，通過對動物模型的表型分析鑒定突變基因的功能。,,根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于動植物細(xì)胞的插入；對于植物

63、細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。,基因捕獲技術(shù)可節(jié)省大量構(gòu)建特異打靶載體，以及篩選染色體組文庫的工作及費用，成為可同時對基因的序列、基因的表達(dá)以及基因的功能進行研究的高效技術(shù)。隨機突變篩選策略能夠獲得功能基因研究的新材料及人類遺傳性疾病的新模型, 這種“表型驅(qū)動”的研究方式有可能成為功能基因組研究最有前景的手段和捷徑。,基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證，尤其是在生物體內(nèi)從整體水平對基因