對生葉序玉米轉(zhuǎn)錄組分析及候選基因篩選與克隆.pdf

1、對生葉序玉米是一種新的變異類型，在玉米中極為少見，它是研究植物葉序形成機理的極具價值的遺傳材料，同時也是一類珍貴的玉米種質(zhì)資源，具有重要的育種學意義。目前國內(nèi)外在對生葉序玉米研究主要集中在對生玉米形態(tài)特征和生理生態(tài)理論、對生葉序基因的標記定位和激素調(diào)控基因指導下的形成機制等方面的研究，上述研究對玉米對生性狀的理論和規(guī)律進行了初步探索和闡述，但是從分子機制上的研究較少。
　　本研究以近等基因系對生葉序玉米(H4D)與互生葉序玉米(H

2、4d)為材料，采用基于Ilumilla/Solexa測序的RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了對互生玉米轉(zhuǎn)錄組文庫，篩選了對/互差異表達基因，并對差異表達基因的COG功能分類、GO顯著富集和Pathway顯著富集進行了分析。在此基礎上，結(jié)合前期對生基因的SSR分子標記定位，利用轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)篩選獲得了玉米對生葉序候選基因并進行了克隆和相關分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、應用Illumina/Solexa測序平臺發(fā)對對生和互生玉米進行轉(zhuǎn)錄組測

3、序，分別獲得10，293，813和11，440，985個clean read，對、互生測序序列Q20=100％（測序錯誤率＜1％），參照B73基因組分析模式，拼接組裝共獲得63540個基因。通過插入片段檢驗、比對統(tǒng)計分析、cDNA片段隨機性實驗檢驗和基因覆蓋度統(tǒng)計等質(zhì)量評估表明Solexa測序質(zhì)量很好，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析信息需求。在此基礎上，對轉(zhuǎn)錄組進行了基礎分析，利用MISA分析軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR分子標記分析共獲得8個類型155

4、82個SSR分子標記;對/互生玉米葉序剪接事件分析發(fā)現(xiàn)對/互生分別發(fā)生了6338和6970個剪接事件，其中內(nèi)含子保留剪接方式占據(jù)多數(shù)，約75％，而ALE、AFE和MEE在本實驗中未發(fā)現(xiàn);利用基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化在對/互生中分別預測了1181和947個新的轉(zhuǎn)錄本，其中共有轉(zhuǎn)錄本940個，僅互生中發(fā)現(xiàn)的有7個，僅對生中發(fā)現(xiàn)有201個，對生葉序玉米中發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本更為豐富。
　　2、以Q_value≤0.01且| Log2(A/B)|≥1作為篩

5、選標準，在對/互生文庫差異比較中共獲得2432個差異基因(DEGs)，進一步就DEGs表達量進行分析發(fā)現(xiàn)5倍以下和5倍以上的表達量差異各占約一半，說明了玉米對生葉序的突變發(fā)生導致了整個轉(zhuǎn)錄水平上眾多基因的表達量變化。在此基礎上，對DEGs進行了COG功能分類、GO和Pathway顯著富集等分析。COG功能分類表明，DEGs中共有954個具有COG分類，分為25類，其中對生葉序玉米在轉(zhuǎn)錄功能、信號轉(zhuǎn)導以及復制、重組和修復等方面上調(diào)基因約占

6、70％，可能在對生葉序發(fā)生過程中有更多的轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導等生物過程發(fā)生;GO條目映射結(jié)果表明在所有的DEGs中，生物學過程、構(gòu)成細胞的組分和分子功能三個分類分別有906個、368個和1643個，進一步應用超幾何檢驗，共獲得14個顯著富集的GO term，其中6條GO富集條目與植物生長發(fā)育或者激素代謝相關。其中，最為顯著的脂肪氧化酶活性和氧化還原酶活性與植物生長發(fā)育、赤霉素合成等直接相關，且在對生都為上調(diào);DEGs的Pathway顯著富集分

7、析表明了共有849個DEGs參與117條代謝途徑，以Q-value≤0.05為閥值，共有15條顯著富集，其中參與植物激素信號轉(zhuǎn)導的Pathway中共有19個DEGs，3個編碼生長素代謝途徑的SAUR家族基因在對生中全部下調(diào)，3個編碼參與細胞分裂素代謝的B-ARR和A-ARR反應調(diào)節(jié)因子基因在對生玉米中全部上調(diào)，這與前期對生玉米內(nèi)源激素生理特性分析相一致。
　　3、結(jié)合玉米對生基因OPP-1和OPP-2的SSR分子標記定位，利用轉(zhuǎn)錄

8、組數(shù)據(jù)，將19個玉米對生葉序差異基因進行了染色體定位，利用比較基因組學和生物信息學分析對染色體定位的差異基因進行了詳細分析，其中11個對生葉序差異基因具有同源基因報道，但是蛋白都沒有明確功能，為預測或未知蛋白。重點篩選確定了SSR標記定位之間的5個差異基因作為候選基因，啟動子分析表明這些基因啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多個與激素（生長素、赤霉素等）和光信號誘導相關的作用元件，可能在植物的激素信號識別及傳導過程中具有重要的作用。以對/互生cDNA為模

9、板進行了這5個基因的克隆，其中GRMZM2G077744_ T01基因成功被克隆，經(jīng)測序和氨基酸序列比對，兩者相似性為97.30％。進化樹分析該基因在單子葉植物中高度保守，屬于信號識別顆粒蛋白，蛋白特征分析表明兩者二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲具有差異，該差異是否會導致相關基因功能變化還有待于進一步研究。
　　綜上所述，本文利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了對/互生玉米轉(zhuǎn)錄組文庫，篩選了差異表達基因，并對差異表達基因的GO和Pathway顯著富集進