狍茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組分析及功能基因克隆檢測.pdf

1、狍(Capreolus pygargus)是我國重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，具有廣泛的市場應(yīng)用前景。本研究通過Illumina/Solexa測序平臺(tái)進(jìn)行狍茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組測序，使用自體組裝軟件Trinity對測序短序列reads進(jìn)行從頭組裝，建立狍茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。并與蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG進(jìn)行序列比對、功能注釋及代謝通路分析;與已有的梅花鹿鹿茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行簡單比較分析;在此基礎(chǔ)上，我們選出癌癥通路

2、中ANXA-2和PTN功能基因進(jìn)行克隆測序，獲得了包含這兩個(gè)基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，并與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中拼接組裝得到的這兩個(gè)Unigene的cDNA序列進(jìn)行比對，以佐證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性。從轉(zhuǎn)錄組水平開展對狍茸的研究，更有利于揭示狍茸的生長機(jī)制，為提高狍茸產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。
　　1、狍茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組測序共得到的5千多萬個(gè)高質(zhì)量短序列reads，采用組裝拼接后共獲得兩端不能再延長的Unigenes36865個(gè)，

3、平均長度932nt，N50值為1579m，接近98％的序列測序質(zhì)量值均在Q20（堿基測序錯(cuò)誤率為1％）。
　　2、在數(shù)據(jù)庫比對及功能基因的注釋過程中，發(fā)現(xiàn)與Nr數(shù)據(jù)庫比對上的Unigenes共22983條，可以直接確定其CDS區(qū)及序列方向。其余序列用ESTscan軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明有510條可能為新的蛋白編碼序列;在COG功能分類，共有8668條Unigenes被歸類到25個(gè)功能類別中;通過GO功能分類，共有18273條

4、Unigenes被歸類到61個(gè)功能類別中;通過KEGG代謝通路分析，共有17284條基因注釋到258個(gè)信號通路中。
　　3、對狍茸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整體篩選分析，按照FPKM值從高到低的順序排序發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量較高的一類蛋白是膠原蛋白，在膠原蛋白中表達(dá)量最高的是COL1A1、COL1 A2，COL16A1、COL9A1、COL27A1。并且發(fā)現(xiàn)至少141種與生長相關(guān)的基因及受體，生長相關(guān)高表達(dá)基因中高表達(dá)的有TGFB3、IGF、TGFBP

5、、IGF4、CTGFP、PDGFR等;挑選出至少259種轉(zhuǎn)錄因子，這一類與轉(zhuǎn)錄相關(guān)高表達(dá)的基因中，表達(dá)量最高的為ATF4、TFAP1、GTFIIF、SNAI2、JunB、TFp65等;挑選出至少384種細(xì)胞外基質(zhì)，大部分的細(xì)胞外基質(zhì)主要集中在膠原類成分。
　　4、克隆包含ANXA-2與PTN基因全部編碼區(qū)的cDNA序列，分別編碼339和168個(gè)氨基酸。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫所測得序列進(jìn)行比對，相似性分別為99.7％和99.0％，進(jìn)一步佐證