MiRNA與功能基因轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析篩選延邊黃牛肉質(zhì)性狀候選基因.pdf

1、本研究以延邊黃牛為研究對象，運用牛全基因組芯片和 miRNA芯片分別分析了閹牛和公牛背最長肌組織的差異表達基因和差異表達 miRNA，采用qRT-PCR技術(shù)對芯片結(jié)果進行了驗證。利用 miRanda程序?qū)Σ町惐磉_ miRNA進行靶基因預(yù)測，并對差異表達基因和差異表達 miRNA進行關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建了 miRNA-基因作用網(wǎng)絡(luò)，對差異靶基因進行 GO功能注釋和 Pathway分析，從而篩選出了影響肉質(zhì)性狀的功能基因和調(diào)控通路，并初步闡明 m

2、iRNA調(diào)控閹牛肉質(zhì)性狀形成的分子機制，為延邊黃牛肉質(zhì)性狀的遺傳機理和在肉牛生產(chǎn)中進行分子育種提供了理論基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）選取延邊黃牛公牛和閹牛各10頭進行肉質(zhì)性狀測定，結(jié)果表明：閹牛肉含水量、粗脂肪含量和大理石花紋等級顯著高于公牛；閹牛的月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、總脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量及背膘厚極顯著高于公牛。在脂肪

3、酸組成比例中，閹牛肉的硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、多不飽和脂肪酸所占比例極顯著低于公牛，月桂酸、豆蔻酸、豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸和單不飽和脂肪酸所占比例極顯著高于公牛，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸所占比例閹牛與公牛差異不顯著。閹牛肉的粗蛋白含量和眼肌面積顯著低于公牛；閹牛肉的剪切力值極顯著低于公牛。
　?。?）隨機選取延邊黃牛公牛和閹牛各3頭，利用 Affymetrix牛全基因組芯片對其背最長肌組織進行差異表達分析。結(jié)果表明：在公

4、牛和閹牛之間共有85個基因存在差異表達，其中30個基因在閹牛中表達上調(diào)，55個基因在閹牛中表達下調(diào)。GO分析結(jié)果表明：32個基因涉及氧和活性氧代謝等生物學(xué)過程；22個基因與細胞頂端組成、II型主要組織相容性復(fù)合體蛋白復(fù)合物組成等細胞組成有關(guān)；39個基因與脂質(zhì)結(jié)合、維生素結(jié)合等分子功能有關(guān)。Pathway分析結(jié)果表明：27個差異基因參與57個 KEGG通路。
　?。?）公牛和閹牛背最長肌組織 miRNA芯片檢測結(jié)果表明：共有3737

5、個miRNA在公牛和閹牛背最長肌中共同表達，其中246個為牛上已知的miRNA，另外3491個為未知 miRNA。對已知的miRNA差異表達分析發(fā)現(xiàn)，有32個 miRNA在公牛和閹牛中存在差異表達，其中25個在閹牛中上調(diào)表達、7個下調(diào)表達。根據(jù)miRNA與靶mRNA間的負調(diào)控關(guān)系，這與閹割后差異表達基因的表達趨勢一致，表明這些 miRNA可能與閹牛和公牛肉質(zhì)差異有關(guān)。并預(yù)測到了差異miRNA的7181個潛在靶基因。
　　（4）選擇

6、差異表達miRNA中的bta-miR-2407、bta-miR-122和bta-miR-15a三個 miRNA和差異表達基因中的CRLF3、ABAT、USP15、SCN4B、ANGPTL4、ROCK2、DGAT2和 FABP4八個基因，對芯片結(jié)果進行了 qRT-PCR驗證，結(jié)果表明：所驗證的miRNA和基因在公牛和閹牛間的差異倍數(shù)均達到顯著水平，其中FABP4、ANGPTL4和SCN4B三個基因達到極顯著水平，與 miRNA芯片和全基因

7、組芯片結(jié)果相符，表明芯片試驗結(jié)果可靠。
　?。?）MiRNA芯片與全基因組芯片結(jié)果的關(guān)聯(lián)分析表明：延邊黃牛公牛和閹牛背最長肌組織32個差異表達miRNA中有26個關(guān)聯(lián)到21個差異靶基因，其中20個miRNA表達上調(diào)、6個miRNA表達下調(diào)。20個表達上調(diào)的miRNA調(diào)控12個靶基因表達下調(diào)，6個表達下調(diào)的miRNA調(diào)控9個靶基因表達上調(diào)。
　?。?）對21個差異靶基因進行GO和Pathway分析。GO分析結(jié)果顯示：閹牛中下調(diào)

8、的差異靶基因分屬于81個生物學(xué)過程、35個細胞組成、33個分子功能。閹牛中上調(diào)的差異靶基因分屬77個生物學(xué)過程、33個細胞組成、44個分子功能。Pathway分析結(jié)果顯示，下調(diào)差異靶基因?qū)?0個 Pathway分類，上調(diào)差異靶基因?qū)?2個 Pathway分類。
　?。?）通過關(guān)聯(lián)分析并結(jié)合文獻報道，初步認為延邊黃牛公牛閹割后，bta-miR-2455、bta-miR-214、bta-miR-216b、bta-miR-671在閹牛背

9、最長肌中表達下調(diào)，其調(diào)控基因 DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5表達量增加；bta-miR-122、bta-miR-1271、bta-miR-16a、bta-miR-200c、bta-miR-16b、bta-miR-29b、bta-miR-221、bta-miR-15a、bta-miR-199c、bta-miR-26b、bta-miR-31、bta-miR-224、bta-miR-27a-3p在閹牛背最長肌中表達量上調(diào)，

10、抑制了其調(diào)控基因ABAT、ATP6V0D2、USP15、DDIT4、FPGT的表達。這些基因參與肌肉組織糖、脂肪、蛋白質(zhì)和能量代謝，主要涉及WNT信號通路，PPAR信號通路，甘油酯代謝，丁酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，mTOR信號通路，β-丙氨酸代謝等，表明這些miRNA與延邊黃牛肉質(zhì)性狀密切相關(guān)。包括 DGAT2、ANGPTL4、ROCK2、PLIN5、ABAT、ATP6V0D2、USP15、D