泥蚶高通量轉(zhuǎn)錄組分析及生長相關基因的克隆與表達研究.pdf

1、泥蚶(Tegillarca granosa)俗稱血蚶，是江、浙、閩沿海居民喜食的海鮮佳品，是我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類之一，也是我國灘涂貝類養(yǎng)殖的主要對象。近年來，隨著泥蚶人工育苗技術的突破和規(guī)?；B(yǎng)殖技術的成熟，泥蚶養(yǎng)殖業(yè)呈快速發(fā)展趨勢，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。然而，與之不相適宜的是，目前泥蚶分子遺傳基礎薄弱、基因組序列信息匱乏、遺傳育種工作剛剛起步，嚴重影響功能基因開發(fā)的進程和分子育種實踐的開展。為此，本研究利用新一代高通量454

2、測序技術對泥蚶不同組織器官和不同發(fā)育階段樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過對高質(zhì)量序列的拼接組裝和基因注釋，發(fā)掘與生長、營養(yǎng)代謝、繁殖、抗病等主要經(jīng)濟性狀相關的候選基因，為后續(xù)開展功能基因研究和分子育種實踐提供有價值信息；利用RACE和RT-PCR技術，對泥蚶生長調(diào)控基因Smad3、BMP7、ERK2、GRB2和蛋白質(zhì)代謝基因LAP3進行基因克隆和表達分析，研究它們與生長的密切關系，篩選可作泥蚶良種選育的候選基因；從泥蚶轉(zhuǎn)錄組中批量開發(fā)和驗證SS

3、R分子標記，為群體遺傳分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、生長性狀主效QTLs的精確定位等研究提供有力工具。主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.基于454 GS FLX高通量測序的泥蚶轉(zhuǎn)錄組分析
　　 應用454高通量測序技術，對泥蚶4個組織和3個發(fā)育階段樣品進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了1170337條高質(zhì)量序列，通過序列拼接得到17940個重疊群(isotig)和131980個單拷貝序列(singleton)，isotig平均長度達到93

4、4bp，測序深度為5.6倍。對泥蚶拼接得到的isotig與Swiss-prot、Nr等公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對，通過GO注釋對基因進行分類，KEGG注釋了解基因間的聯(lián)系和生物體的生化代謝網(wǎng)絡。從注釋的基因中鑒別出大量調(diào)控泥蚶肌肉、上皮、神經(jīng)、纖維等的生長因子及受體，找到了與生長相關的TGFβ信號通路、MAPK信號通路中的多個重要基因；查找到大量與生長、發(fā)育、繁殖和免疫等生產(chǎn)相關的候選基因，為后續(xù)開展功能基因研究和分子育種實踐有重要價值。在泥

5、蚶轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)血紅素合成過程中的大部分關鍵酶，推瓣貝類血紅蛋白合成的基本過程可能與脊椎動物十分相似。另外，從泥蚶轉(zhuǎn)錄組中檢測到6338個SSR和20038個SNP候選標記，為分子標記的大規(guī)模開發(fā)提供了重要資源。
　　 2.利用泥蚶轉(zhuǎn)錄組序列大量開發(fā)微衛(wèi)星標記，并研究其引物在毛蚶中的通用性
　　 EST文庫篩查法是目前大量開發(fā)微衛(wèi)星標記的重要方法，具有方法簡便、花費低廉等優(yōu)點。本研究從泥蚶454轉(zhuǎn)錄組測序得到的大量iso

6、tig和singleton序列中搜索到6338個SSR位點，可用于大規(guī)模開發(fā)SSR標記。在3828條isotig序列里，共檢測到138條適合設計引物的序列，擴增得到81個穩(wěn)定擴增的位點，這些位點在泥蚶奉化群體中進行多態(tài)性檢測，共擴增出242個等位基因，各位點的等位基因數(shù)為2～9個，平均每個位點產(chǎn)生3.90個等位基因，觀測雜合度為0.040～1.000，期望雜合度為0.040～0.844，多態(tài)信息含量為0.038～0.806。33個SSR

7、來自注釋基因序列，對這些基因的準確定位有很大幫助。用62對泥蚶多態(tài)性SSR引物在毛蚶中進行了通用性驗證，結(jié)果有22對成功擴增，16對表現(xiàn)為多態(tài)，這些多態(tài)位點可作為毛蚶和泥蚶的通用性標記。
　　 3.泥蚶Smad3基因的克隆與表達分析
　　 Smad3是TGF-β通路的重要成員，可將信號分子從細胞表面受體傳導至細胞核，是重要的生長調(diào)控因子。利用RACE技術擴增得到泥蚶Smad3基因2341bp的cDNA全長，編碼423個氨

8、基酸。蛋白質(zhì)功能域分析表明，Tg-Smad3含有兩個保守功能域MH1和MH2。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，它與脊椎動物的同源性達到80％以上，說明Tg-Smad3氨基酸序列十分保守。RT-PCR結(jié)果表明，Tg-Smad3在泥蚶各成體組織都有表達，其中足和血液中表達量最高，可能與細胞增殖和免疫過程有關；在早期發(fā)育階段，Tg-Smad3的表達量呈逐漸升高的趨勢，在D形幼蟲時期表達量最高，推測其參與貝殼的形成過程。
　　 4.泥蚶BMP7基因

9、的克隆與表達分析
　　 BMP7也是TGF-β通路中的重要成員，在生物體內(nèi)具有重要且廣泛的生物功能，參與骨骼的生長、代謝，調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，并在生殖系統(tǒng)的生長、發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究克隆得到Tg-BMP7基因的cDNA全長，開放閱讀框為1275bp，編碼425個氨基酸。功能域預測表明，Tg-BMP7是一個糖蛋白，包含由29個氨基酸組成的信號肽，3個二硫鍵，并有一個TGF-β家族信號。RT-PCR結(jié)果顯示，Tg-BM

10、P7在成貝外套膜和鰓中表達量高；在早期發(fā)育階段中，D形幼蟲的表達量顯著高于原腸胚、擔輪幼蟲和幼貝，推測Tg-BMP7可能參與貝殼的形成過程，并具有組織分化、調(diào)控胚胎生長發(fā)育等生理功能。
　　 5.泥蚶ERK2基因的克隆與表達分析
　　 ERK2是MAPK家族重要的反應激酶系統(tǒng)，主要參與調(diào)控細胞生長、分化和細胞周期調(diào)控等生理功能。泥蚶ERK2基因cDNA全長1673bp，編碼359個氨基酸，功能域預測找到一個絲氨酸/蘇氨酸

11、蛋白激酶的活性區(qū)域，這是ERK家族蛋白的特征性區(qū)域。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，Tg-ERK2蛋白與脊椎動物的同源性達到80％以上，說明該基因十分保守，可能功能與脊椎動物有類似之處。RT-PCR結(jié)果表明，Tg-ERK2在泥蚶各組織、各個發(fā)育階段都有表達，說明Tg-ERK2功能強大，參與到多種生命活動中去；相對而言，Tg-ERK2在泥蚶成體的血液中表達量最高；而在早期發(fā)育階段中表達量逐漸升高，D形幼蟲期達到最高，這可能與此期細胞分化

12、加劇、神經(jīng)細胞形成較多有關。
　　 6.泥蚶GRB2基因的克隆與表達分析
　　 GRB2蛋白是一個重要的接頭分子，參與細胞內(nèi)各種受體激活后的下游調(diào)節(jié)，調(diào)控細胞的增殖和分化。Tg-GRB2基因全長1275bp，編碼236個氨基酸。Tg-GRB2蛋白包含3個功能域，1個SH2和2個SH3，這是GRB2發(fā)揮生理功能的活性區(qū)域。Tg-GRB2在泥蚶不同組織中的表達量由大到小依次為：血液>足>鰓>外套膜>閉殼肌>內(nèi)臟團；在早期發(fā)育

13、階段中，GRB2基因在原腸胚、擔輪幼蟲、D形幼蟲中均有較高的表達量，原因可能是隨著胚胎發(fā)育過程的進行，細胞分裂速度加快，生命活動旺盛，信號傳導需要較多的接頭蛋白
　　 7.泥蚶蛋白質(zhì)代謝基因LAP3的克隆與表達分析
　　 LAP3是M17類蛋白家族的一員，在細胞成熟、細胞生長、調(diào)節(jié)損傷防御、維持細胞動態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。Tg-LAP3基因全長為1590bp，編碼530個氨基酸，包括Peptidase_M17超家族序列