基于P物質和降鈣素基因相關肽的神經免疫調節(jié)對小鼠同種異體皮膚移植物存活影響的研究.pdf

1、腎臟移植是治療終末期腎臟疾病的最有效手段之一，但到目前為止，仍有一些問題制約著腎移植的發(fā)展，現有免疫抑制藥物會帶來的各種不良反應和副作用，移植患者容易發(fā)生各種感染;免疫移植藥物代謝的個體差異直接影響到臨床藥物劑量的調整，有部分患者的治療窗非常狹窄，在發(fā)生嚴重感染的同時合并排斥反應。
　　鈣調神經蛋白抑制劑（calcineurin inhibitors，CNIs）類藥物是器官移植術后免疫抑制方案的基石，但其有自身的缺點，CNIs類藥

2、物引起的慢性腎臟毒性是導致移植物遠期存活率下降的主要原因之一。針對上述制約器官移植發(fā)展的問題，基礎研究者和臨床工作者在進行大量的探索，試圖找到更為理想的解決方案。本研究將探索神經免疫調節(jié)手段在同種異體移植當中的作用。
　　神經系統和免疫系統密不可分。在神經原性炎癥中，P物質(substance P，SP)和降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是神經纖維末梢最初釋放的神經肽類物

3、質，也是最重要的肽類物質，均可誘發(fā)神經性炎癥反應，神經原性炎癥以神經網絡為基礎，通過軸突反射和背根反射擴大作用范圍，在神經原性炎癥中，SP和CGRP表現為協同作用。
　　免疫細胞表面表達特異性的神經肽類物質受體，神經肽能夠與其結合，調節(jié)免疫細胞的功能，但SP和CGRP所表現出來的免疫學效應卻截然相反:SP刺激T細胞增殖，CGRP抑制T細胞活化。
　　由于神經網絡具有廣泛分布的特點，神經免疫調節(jié)具有迅速使大量免疫細胞的狀態(tài)得到

4、同化的潛能。而不同神經肽具有相反免疫學效應的特點提示基于神經免疫水平的調節(jié)可能是移植免疫中一個重要的調節(jié)點?；谏窠浰降拿庖哒{節(jié)由于間接作用于免疫器官和免疫細胞，可能具有傳統免疫調節(jié)方法所不具備的特殊優(yōu)點。但這種調節(jié)方法是否具有足夠強的免疫調節(jié)能力，能否有效預防移植物的排斥反應還沒有相關研究。本研究通過建立小鼠同種異基因皮膚移植模型，研究神經免疫調節(jié)對皮膚移植物的存活、Th1和Th2細胞亞群平衡、調節(jié)性T細胞(Tregs)和T淋巴細胞

5、各活化通路關鍵信號分子的影響，初步探索神經免疫調節(jié)在同種異基因組織移植中所占的地位和作用。
　　第一章小鼠同種異基因皮膚移植模型的建立
　　目的:成功建立小鼠同種異基因皮膚移植模型。
　　方法:分別對BALB/c小鼠進行自體皮膚移植和異基因皮膚移植，皮膚移植采用全厚皮片移植，觀察并記錄移植皮片的存活情況。
　　結果:異基因皮膚移植小鼠術后4天，皮面光滑，開始轉紅，無浮動現象，7天時皮膚迅速出現排斥反應，皮膚皺縮、

6、僵硬，呈干性壞死，出現黑痂狀。自體皮膚移植小鼠術后6天，皮面光滑，開始轉紅，無浮動現象，打包固定期間，皮片未收縮，12天時全部皮片均已愈合牢固，柔韌性好，并開始長出皮毛。拆線后，皮片開始收縮，術后25天的收縮率達40-50％，以后未再繼續(xù)收縮。
　　結論: 小鼠同種異基因全厚皮片移植模型建立成功; 該模型是研究排斥反應和相應干預手段的理想動物模型;任何外科手術都會誘發(fā)不同程度的神經原性炎癥，該動物模型是研究神經免疫調節(jié)的良好載體。

7、
　　第二章神經免疫調節(jié)對同種異基因皮膚移植小鼠皮膚移植物存活的影響
　　目的:利用成功建立的小鼠皮膚移植模型，對接受皮膚移植的小鼠使用不同的神經肽受體拮抗劑進行干預，觀察并比較各組皮膚移植物的存活時間。
　　方法:對接受自體皮膚移植和異體皮膚移植的小鼠進行分組，分別施加生理鹽水、SP受體拮抗劑Spantide、CGRP受體拮抗劑BIBN4096BS以及Spantide+BIBN4096BS干預，比較各組小鼠皮膚移植物

8、的存活時間，皮膚移植物存活時間的組間比較采用Kaplan-Meier法。
　　結果:觀察時間為25天，自體皮膚移植小鼠的皮膚移植物平均存活25天;異基因皮膚移植注射生理鹽水的對照組小鼠皮膚移植物平均存活時間為7天;異基因皮膚移植注射SP受體拮抗劑Spantide的小鼠皮膚移植物平均存活時間為13天;異基因皮膚移植注射CGRP受體拮抗劑BIBN4096BS的小鼠皮膚移植物平均存活時間為12天;異基因皮膚移植同時注射SP受體拮抗劑Sp

9、antide和CGRP受體拮抗劑BIBN4096BS的小鼠皮膚移植物平均存活時間為19天。
　　結論:
　　SP和CGRP調節(jié)均能夠延長小鼠異基因皮膚移植物的存活時間;
　　SP和CGRP調節(jié)在延長小鼠異基因皮膚移植物的存活時間方面無顯著差異;
　　SP/CGRP共同調節(jié)能進一步顯著延長小鼠異基因皮膚移植物的存活時間，說明SP和CGRP調節(jié)在神經免疫學層面也具有協同作用;
　　與傳統免疫抑制藥物相比，基于S

10、P和CGRP的神經免疫調節(jié)對異基因皮膚移植物的存活時間延長作用有限，但不失為一種有潛力的研究方向。
　　第三章小鼠皮膚移植物中SP和CGRP免疫組織化學分析和SP mRNA/CGRP mRNA熒光定量PCR分析
　　目的:對小鼠皮膚移植物中的SP和CGRP從蛋白肽水平和基因水平進行定性和定量分析。
　　方法:
　　1、對小鼠皮膚移植物中的SP和CGRP進行免疫組化染色。
　　2、對小鼠皮膚移植物中的SP m

11、RNA/CGRP mRNA進行熒光定量PCR分析。
　　3、熒光定量PCR結果的分析采用SPSS18.0統計分析軟件，各指標組間比較采用方差分析，方差分析后，兩兩比較使用LSD法，兩組間比較采用t檢驗。
　　結果:
　　1、免疫組化結果顯示，自體皮膚移植小鼠皮膚移植物存活良好，表皮層厚度正常，可見皮膚附件:異體皮膚移植小鼠移植皮片表皮層變薄，皮膚附件消失。
　　2、SP拮抗和CGRP拮抗均能同時抑制SP和CGRP

12、的表達，SP+CGRP雙重拮抗使得這種抑制效應更加明顯。
　　3、對施加同種干預的自體移植和異體移植小鼠進行比較，發(fā)現異基因皮膚移植組CGRP的表達程度明顯低于自體皮膚移植組。
　　4、對接受自體皮膚移植的小鼠進行組織內SP mRNA定量的組間比較，發(fā)現Ctrl②組SP mRNA的表達量顯著高于SP②組和SP+CGRP②組，而與CGRP②組無顯著差異;SP②組SP mRNA的表達量顯著低于CGRP②組，與SP+CGRP②組S

13、P mRNA的表達量無顯著差異; CGRP②組SP mRNA的表達量顯著高于SP+CGRP②組。
　　5、對接受異體皮膚移植的小鼠進行組織內SP mRNA定量的組間比較，發(fā)現Ctrl①組SP mRNA的表達量顯著高于SP①組、CGRP①組和SP+CGRP①組;SP①組SP mRNA的表達量顯著低于CGRP①組和SP+CGRP①組;CGRP①組SP mRNA的表達量顯著高于SP+CGRP①組。
　　6、對接受自體皮膚移植的小鼠

14、進行組織內CGRP mRNA定量的組間比較，發(fā)現Ctrl②組CGRP mRNA的表達量顯著高于CGRP②組，而與SP②組和SP+CGRP②組無顯著差異;SP②組CGRP mRNA的表達量顯著高于CGRP②組和SP+CGRP②組;CGRP②組CGRPmRNA的表達量顯著高于SP+CGRP②組。
　　7、對接受異體皮膚移植的小鼠進行組織內CGRP mRNA定量的組間比較，發(fā)現Ctrl①組CGRP mRNA的表達量顯著高于CGRP①組和

15、SP+CGRP①組，而與SP①組無顯著差異:SP①組CGRP mRNA的表達量顯著高于CGRP①組和SP+CGRP①組;CGRP①組CGRPmRNA的表達量與SP+CGRP①組無顯著差異。
　　8、對接受同一干預的皮膚移植小鼠分別進行異體-自體之間SPmRNA表達量的比較:接受生理鹽水注射的自體移植小鼠其皮膚移植物內SP mRNA表達量顯著低于異體移植小鼠;接受SP受體拮抗劑的自體移植小鼠其皮膚移植物內SP mRNA表達量顯著高于

16、異體移植小鼠;接受CGRP受體拮抗劑的自體移植小鼠其皮膚移植物內SPmRNA表達量與異體移植小鼠無顯著差異;接受SP+CGRP雙重拮抗的自體移植小鼠其皮膚移植物內SP mRNA表達量顯著低于異體移植小鼠。
　　9、對接受同一干預的皮膚移植小鼠分別進行異體-自體之間CGRP mRNA表達量的比較:接受生理鹽水注射的自體移植小鼠其皮膚移植物內CGRP mRNA表達量顯著低于異體移植小鼠;接受SP受體拮抗劑的自體移植小鼠其皮膚移植物內C

17、GRP mRNA表達量顯著低于異體移植小鼠;接受CGRP受體拮抗劑的自體移植小鼠其皮膚移植物內CGRP mRNA表達量顯著高于異體移植小鼠;接受SP+CGRP雙重拮抗的自體移植小鼠其皮膚移植物內CGRP mRNA表達量顯著高于異體移植小鼠。
　　結論:
　　在小鼠皮膚移植模型中，外科手術是神經原性炎癥的始動因素，繼發(fā)的神經原性炎癥的自我增強和產生神經免疫學效應不依賴于外科手術的影響而獨立存在;
　　單一阻斷SP與其受體

18、結合不但影響SP的合成和表達，同時也影響CGRP的合成和表達;在單獨使用CGRP拮抗劑的小鼠體內也觀察到類似的現象，這說明SP和CGRP具有交叉反饋和協同作用;
　　SP+CGRP雙拮抗能進一步降低SP和CGRP的表達，但不能完全阻斷SP和CGRP的表達，這可能是神經免疫調節(jié)一個重要的缺陷，也是本研究中異基因皮膚移植物存活時間不長的原因之一:
　　機體在面對異基因移植物時，可能會在神經免疫學層面產生一種免疫增強機制，加速免疫

19、反應對皮膚移植物的破壞，而SP+CGRP雙拮抗能有效減弱這種效應;
　　在神經免疫調節(jié)過程中，神經肽mRNA的表達和神經肽的產生并不呈絕對的線性關系;
　　與神經原性炎癥相比，同種異體免疫反應能夠顯著促進皮膚移植物中SP mRNA的表達。
　　第四章皮膚移植小鼠外周血Th1因子和Th2因子的檢測
　　目的:通過檢測接受皮膚移植小鼠外周血中的Th1因子IFN-γ、IL-2和Th2因子IL-10，間接評估神經免疫調節(jié)

20、對小鼠免疫系統的影響。
　　方法:
　　1、利用ELISA技術對小鼠外周血中的Th1因子IFN-γ和IL-2進行定量檢測。
　　2、利用ELISA技術對小鼠外周血中的Th2因子IL-10進行定量檢測。
　　3、采用SPSS18.0統計分析軟件對檢測結果進行分析，各指標組間比較采用方差分析，方差分析后，兩兩比較使用LSD法，兩組間比較采用t檢驗。
　　結果:
　　1、神經免疫調節(jié)使接受自體/異體皮膚移植

21、的小鼠外周血IFN-γ表達量下降，且影響作用的大小依次為SP+CGRP雙重拮抗＞CGRP拮抗＞SP拮抗＞NS。
　　2、神經免疫調節(jié)使接受自體/異體皮膚移植的小鼠外周血IL-2表達量下降，且影響作用的大小依次為SP+CGRP雙重拮抗＞CGRP拮抗＞SP拮抗＞NS。
　　3、神經免疫調節(jié)使接受自體/異體皮膚移植的小鼠外周血IL-10表達量增加，且影響作用的大小依次為SP+CGRP雙重拮抗＞CGRP拮抗＞SP拮抗＞NS。

22、　　4、對接受不同干預措施的小鼠進行組間自體-異體比較，發(fā)現異體移植小鼠外周血IL-2、IFN-γ、IL-10的表達量均低于自體移植組，且絕大部分干預組均有顯著差異。
　　結論:
　　1、從Th1和Th2亞群細胞因子的角度進行分析，基于SP和CGRP的神經免疫調節(jié)確實能夠對異基因皮膚移植物產生保護作用，這種保護作用的強度表現為:SP+CGRP雙重拮抗＞CGRP拮抗＞SP拮抗。
　　2、在自體皮膚移植組，神經肽拮抗劑也能

23、引起Th1因子和Th2因子產生類似于異基因皮膚移植小鼠外周血表達含量的變化，這說明這種神經免疫調節(jié)手段對免疫系統的影響不依賴于異基因免疫反應的存在。
　　3、GCRP拮抗對異基因皮膚移植組小鼠Th1因子的影響要大于對自體皮膚移植組小鼠Th1因子的影響，這種調節(jié)方式對Th2因子的影響在兩組之間則沒有體現出差異，這可能與CGRP在異基因皮膚移植小鼠模型中表達下降有關，這也是本研究所揭示的CGRP拮抗所產生的免疫保護作用強于SP拮抗的原

24、因。
　　第五章小鼠淋巴細胞活化通路關鍵信號分子定量分析
　　目的:對皮膚移植小鼠淋巴細胞活化三條通路上的關鍵信號分子進行定量分析，檢測神經免疫調節(jié)手段會如何對上述通路產生影響，
　　方法:
　　1、利用熒光定量PCR技術對小鼠MAPK通路信號分子的表達進行定量分析。
　　2、利用熒光定量PCR技術對小鼠Calcineurin/NFAT通路信號分子的表達進行定量分析。
　　3、利用熒光定量PCR技術對

25、小鼠JAK-STAT通路信號分子的表達進行定量分析。
　　4、采用SPSS18.0統計分析軟件對檢測結果進行分析，各指標組間比較采用方差分析，方差分析后，兩兩比較使用LSD法，兩組間比較采用t檢驗。
　　結果:
　　1、對MAPK通路的4個關鍵信號分子進行定量分析，發(fā)現基于SP/CGRP的神經免疫調節(jié)手段對ERK基因表達無影響;對JNK2基因表達的影響可能主要和炎癥反應有關;該調節(jié)對JNK1基因和P38MAPK基因表達

26、產生的影響正好相反:SP調節(jié)促進自體皮膚移植小鼠P38 MAPK基因的表達，抑制異體皮膚移植小鼠JNK1基因的表達，CGRP調節(jié)抑制異體皮膚移植小鼠P38 MAPK基因的表達，促進自體皮膚移植小鼠JNK1基因的表達。
　　2、對Calcineurin/NFAT通路的2個基因進行了定量分析，發(fā)現神經免疫調節(jié)能夠同時促進Calcineurin/NFAT通路中的NFAT基因和Calcineurin基因表達增加，其中SP調節(jié)誘導NFAT基

27、因表達的作用較強，而CGRP調節(jié)誘導Calcineurin基因表達的作用較強。
　　3、對JAK/STAT通路的2個基因進行了定量分析，發(fā)現神經免疫調節(jié)對JAK1基因和Tyk2的表達幾乎無明顯影響。
　　結論:
　　1、基于SP/CGRP的神經免疫調節(jié)手段對MAPK通路的ERK基因和JNK2基因表達無影響或與移植物的存活無關;對JNK1基因和P38 MAPK基因表達產生的影響正好相反:SP調節(jié)促進自體皮膚移植小鼠P38

28、 MAPK基因的表達，抑制異體皮膚移植小鼠JNK1基因的表達，CGRP調節(jié)抑制異體皮膚移植小鼠P38 MAPK基因的表達，促進自體皮膚移植小鼠JNK1基因的表達。
　　2、基于SP/CGRP的神經免疫調節(jié)手段能夠同時促進Calcineurin/NFAT通路中的NFAT基因和Calcineurin基因表達增加，其中SP調節(jié)誘導NFAT基因表達的作用較強，而CGRP調節(jié)誘導Calcineurin基因表達的作用較強。
　　3、基于

29、SP/CGRP的神經免疫調節(jié)對JAK1基因表達無影響;對異體移植小鼠Tyk2的表達幾乎無明顯影響。
　　第六章小鼠外周血CD4+CD25+Treg和Foxp3的表達檢測
　　目的:探索神經免疫調節(jié)是否具有足夠的誘導CD4+CD25+Treg形成的能力。
　　方法:
　　1.利用熒光定量PCR技術對小鼠皮膚移植物中的Foxp3進行定量分析;
　　2.利用流式細胞技術對小鼠外周血中的CD4+CD25+Treg細

30、胞進行分選和檢測;
　　3.熒光定量PCR的結果使用SPSS18.0進行分析，流式細胞技術的結果使用BD FACS CantoTMⅡ統計軟件進行分析。各指標組間比較采用方差分析，方差分析后，兩兩比較使用LSD法，兩組間比較采用t檢驗。
　　結果:
　　1.接受神經免疫調節(jié)的小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞的百分比升高，這種調節(jié)方式對Treg的影響程度依次為SP調節(jié)＞SP+CGRP調節(jié)＞CGRP調節(jié)

31、＞NS對照(P＜0.05);
　　2.將施加同一種干預的自體移植小鼠和異體移植小鼠進行比較，發(fā)現各組自體移植小鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs細胞的百分比均顯著低于異體移植小鼠(P＜0.05);
　　3.Foxp3 mRNA定量的結果和CD4+CD25+Foxp3+Tregs流式細胞檢測的結果并不完全一致，這可能是由于標本來源不同所致。
　　結論:
　　1.神經免疫調節(jié)能夠促使小鼠外周血CD4+