構(gòu)建降鈣素基因相關(guān)肽的穿梭載體.pdf

1、背景:降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是1983年應(yīng)用DNA基因重組技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)舒血管活性多肽,由37個(gè)氨基酸組成,它是降鈣素基因在神經(jīng)組織經(jīng)翻譯后表達(dá)的產(chǎn)物.CGRP廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化道和內(nèi)分泌等系統(tǒng).CGRP具有很強(qiáng)的舒血管活性,對(duì)心、腦血管有強(qiáng)大的擴(kuò)張作用.CGRP與許多臨床疾病有密切關(guān)系,是目前研究的熱點(diǎn)之一. 近年來(lái),隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,基因?qū)爰夹g(shù)得到不斷改進(jìn)并在基

2、因治療中顯示了良好的應(yīng)用前景.腺病毒載體是目前基因治療中應(yīng)用最廣泛的一種病毒載體,作為非整合病毒,具有感染宿主范圍廣,外源基因表達(dá)水平高,在受染細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生整合,沒有致癌和致突變的危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn),在基因?qū)胙芯恐斜妒荜P(guān)注. 方法:本實(shí)驗(yàn)以25g普通成年雄性小白鼠為取材對(duì)象,從小鼠脊髓背根神經(jīng)元中獲取總RNA,在引物兩端導(dǎo)入限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列,通過RT-PCR擴(kuò)增得到CGRP的全序列.通過雙酶切和連接反應(yīng)將CGRP基因?qū)隤UC5

3、7載體上,通過轉(zhuǎn)化,篩選,將鑒定為陽(yáng)性的重組PUC57-CGRP質(zhì)粒與pShuttle-CMV質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和載體連接反應(yīng),最后得到重組pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭質(zhì)粒. 結(jié)果: 1.成功通過RT-PCR擴(kuò)增得到CGRP目標(biāo)序列,全長(zhǎng)433bp. 2.成功構(gòu)建重組PU3C57-CGRP質(zhì)粒. 3.成功構(gòu)建pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭質(zhì)粒. 結(jié)論:腺病毒載體理化性質(zhì)穩(wěn)