大腸桿菌O157二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)及分離菌株的分子多態(tài)性分析.pdf

1、大腸桿菌O157是腸出血性大腸桿菌的主要血清型，能夠引起人類出血性腹瀉及溶血性尿毒綜合征(HUS)等。流行病學(xué)研究表明極低量的大腸桿菌O157即可致感染，因此高敏感度的檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)大腸桿菌O157顯得尤其重要。 以大腸桿菌O157 rfb和stx2為待檢靶基因，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和兩條MGB探針，以rfbE為靶基因的探針，5’端用FAM基團(tuán)標(biāo)記，3’端用Taqman-MGB標(biāo)記，以stx2為靶基因的探針，5’端用VIC基團(tuán)標(biāo)記，3’

2、端用Taqman-MGB標(biāo)記?；赥aqman探針技術(shù)，建立并優(yōu)化了檢測(cè)大腸桿菌O157的二重?zé)晒舛縋CR方法。可檢測(cè)的最低DNA濃度是10<'0>拷貝/μL；試驗(yàn)中已知O157菌株檢測(cè)結(jié)果為rfbE陽(yáng)性，而非O157菌株檢測(cè)結(jié)果為陰性；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，批間差異小于80％，批內(nèi)差異小于70％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，此二重?zé)晒舛縋CR方法既可鑒定分離的菌株是否為大腸桿菌O157，又可得知菌株是否攜帶stx2毒力基因，有利于判定菌株是否有致病性。

3、 用建立的以rfbE和stx2為靶基因的二重?zé)晒舛縋CR，鑒定2000-2004年間分離的64株來源于動(dòng)物組織和糞便的細(xì)菌。并應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行模擬樣本的檢測(cè)，采集的豬肉肉樣無菌處理剪碎后置于10mL EC(含20μg/mL新生霉素)肉湯中，利用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得大腸桿菌O157標(biāo)準(zhǔn)株純培養(yǎng)液濃度，作10倍倍比稀釋，將不同濃度的菌液分別接種到肉糜EC肉湯中，制備得含不同細(xì)菌濃度的模擬樣本，分別提取各樣本中細(xì)菌基因組作模板，進(jìn)

4、行二重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明：10株細(xì)菌針對(duì)rfbE和stx2均能產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線，54株細(xì)菌的擴(kuò)增曲線位于域值線以下，即未出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。說明出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的10株細(xì)菌是大腸桿菌O157，未出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的54株細(xì)菌是非O157大腸桿菌，熒光定量PCR法和血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果完全一致。大腸桿菌O157標(biāo)準(zhǔn)株純培養(yǎng)液濃度為3.05×10<'6>CFU/μL，模擬樣本熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度為3.05×10<'0>CFU/μ L，即每克

5、豬肉中含有30.5個(gè)細(xì)菌就可以檢出，提供了一個(gè)敏感、特異的檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O157的方法。 為了解分離菌株的分子分型特征，建立了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性和質(zhì)粒圖譜分析兩種分型方法，對(duì)10株從糞便和動(dòng)物組織分離的大腸桿菌O157進(jìn)行了分型研究，結(jié)合重要毒力基因的檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證分離菌株之間的親緣關(guān)系。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析分別在遺傳距離為0.89、0.973處將所有細(xì)菌分類：兩株具有相似的擴(kuò)增圖譜，可以聚為一大類，其余8株細(xì)菌進(jìn)