快速檢測腸出血性大腸桿菌O157實時熒光環(huán)介導等溫擴增技術的建立.pdf

1、目的:腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157，其典型血清型為O157∶H7，是一種強的致病性細菌，會導致出血性腹瀉和腸炎，發(fā)病很快，病情嚴重時可致死。該菌常常污染動物性食品。因此，開發(fā)大腸桿菌O157∶H7新的快速檢測方法，可及時檢出病原菌，避免食物中毒發(fā)生。
　　環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，L

2、AMP）在恒溫條件下即可實現DNA擴增，但若精確判定結果通常需要繁瑣的電泳，且增加了耗時。因此，改進LAMP檢測技術，建立新型的LAMP檢測方法，以省去繁瑣的電泳操作步驟，減少耗時，還可進一步提高靈敏度，為大腸桿菌O157∶H7的快速、高靈敏度的檢測探索了新途徑。
　　方法:本研究將LAMP技術與熒光技術相結合，利用實時熒光監(jiān)測儀，通過電腦軟件對整個LAMP反應進行實時監(jiān)測，實現了大腸桿菌O157∶H7的快速、高靈敏度檢測，并將該

3、技術稱為實時熒光環(huán)介導等溫擴增技術(Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology, RF-LAMP)。
　　根據NCBI(Genbank)中公布的大腸桿菌O157∶H7編碼O抗原的rfbE基因保守序列，用Primer Explorer V3 LAMP引物設計軟件進行了大腸桿菌O157∶H7的LAMP引物設計。對整個RF-LAMP反應

4、體系進行了優(yōu)化，并對RF-LAMP擴增產物進行分析。研究了RF-LAMP檢測方法的特異性、靈敏度、模板DNA提取方法和人工污染食品（以牛肉為例）的檢出限，并與環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)法進行了比較。其研究結果如下。
　　結果:經優(yōu)化確定了反應體系和程序。反應體系（共25 μL）:10 μMF3和B3各1μL，10 μM FIP和BIP各3μL，模板DNA 2.5 μL，2.5 mmol/L High Pure dNTPs 4μ

5、L,50 mM MgSO4 1 μL,10×ThermoPolTM Reaction Buffer 4 μL,5M甜菜堿3 μL,8000 U/ml Bst DNA聚合酶大片段1.2 μL，1 μL SYBR Green Ⅰ（1∶300稀釋），其余無菌蒸餾水補足。反應程序:溫度為63 ℃，時間為60 min，可根據實際反應進程隨時終止反應。
　　利用RF-LAMP技術檢測大腸桿菌O157∶H7，省去繁瑣的電泳操作步驟，減少耗時，比

6、LAMP檢測O157∶H7的方法更加快捷，最短30 min即可判定結果。
　　實時熒光曲線直觀判斷、凝膠電泳分析及熔解曲線的實驗結果，表明RF-LAMP擴增反應是正確的。
　　在RF-LAMP技術檢測大腸桿菌O157∶H7的特異性試驗中，共有21株試驗菌株，其中有兩株為大腸桿菌O157∶H7和另外兩株大腸桿菌O157∶Hund出現了擴增曲線，判定為陽性結果，其他17株非大腸桿菌O157，均沒有擴增曲線出現，判定為陰性結果。<

7、br>　　檢測大腸桿菌O157∶H7純菌的靈敏度為5.1 CFU/mL，其靈敏度是LAMP檢測方法的10倍。
　　分別利用普通熱裂解法、化學試劑法和試劑盒法比較了人工污染牛肉中大腸桿菌O157∶H7基因組DNA的提取效果，實驗結果表明三種方法對擴增反應結果影響的差別很小，綜合考慮選擇普通熱裂解法提取人工污染牛肉中大腸桿菌O157∶H7基因組DNA，速度快、成本低。通過實驗測定人工污染牛肉的大腸桿菌O157∶H7檢出限為5.1 CF