大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在溫敏型殼聚糖水凝膠中的生長(zhǎng)觀察.pdf

1、目的：組織工程的常用方法是，將種子細(xì)胞種植于一種生物相容性良好并可被人體逐漸降解吸收的生物材料上進(jìn)行擴(kuò)增，形成細(xì)胞/生物材料結(jié)構(gòu)物后回植體內(nèi)修復(fù)受損組織。此時(shí)生物材料支架為細(xì)胞提供生存所需的三維空間，對(duì)細(xì)胞的有序構(gòu)筑起接觸、引導(dǎo)及支架作用，使細(xì)胞能在預(yù)先設(shè)計(jì)的三維形狀支架上生長(zhǎng)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)在體內(nèi)及體外具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，其具有來(lái)源廣泛、易于培養(yǎng)和自體移植不引起排斥反應(yīng)、不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建組織工程的理想種子細(xì)

2、胞來(lái)源。為尋找理想的組織相容物，本實(shí)驗(yàn)觀察MSCs在殼聚糖/β-磷酸甘油鈉(C/GP)凝膠中的存活和生長(zhǎng)，有望為微創(chuàng)方式修復(fù)腦損傷摸索一種新的可注射性組織工程MSCs，為應(yīng)用自體干細(xì)胞移植尋找較合適的可注射性載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1.取SD大鼠(體重50-60g)，麻醉處死后無(wú)菌條件下取雙側(cè)股、脛骨的骨髓，用貼壁培養(yǎng)法分離出MSCs，進(jìn)行培養(yǎng)，并傳代擴(kuò)增以純化MSCs，并連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性。 2. 室溫狀態(tài)下

3、用吸管將β-甘油磷酸鈉溶液緩慢滴入殼聚糖溶液中，邊滴加邊混勻，按照(9-1)：1梯度體積比配置成C/GP復(fù)合溶液，分別測(cè)混合液的PH值及37℃條件下的凝固時(shí)間(以凝膠在容器內(nèi)倒置90°不流動(dòng)、不變形為凝膠形成的標(biāo)準(zhǔn))，選擇最適混合比。 3. 取傳3代的MSCs，以5.0×10<'4>/ml密度，接種于C/GP(體積比3∶2)混合溶液中，加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孑乙加0.09ml的細(xì)胞-C/GP復(fù)合物，置37℃孵箱10 min

4、形成凝膠后，每孔加入完全培養(yǎng)液0.1ml，每日換液。隔日在倒置顯微鏡下觀察MSCs三維培養(yǎng)。 4. 制備單細(xì)胞懸液加完全培養(yǎng)基，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔20μl細(xì)胞懸液加C/GP復(fù)合物10μl，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；每孔取20μl細(xì)胞懸液加10μl完全培養(yǎng)基，設(shè)為細(xì)胞對(duì)照組；每孔取10μl C/GP復(fù)合物加完全培養(yǎng)基20μl，設(shè)為C/GP對(duì)照組。從第2天起，24h后每組取3孔細(xì)胞用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，連續(xù)7d，繪制生長(zhǎng)曲線分別。對(duì)兩組的OD值

5、作t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果：1.分離出的MSCs呈圓形，約72h后絕大多數(shù)細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞形態(tài)為梭形，多角形，約7～10天可達(dá)80％融合，此時(shí)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞成長(zhǎng)快，約3～7天基本鋪滿瓶底。 2. 在室溫時(shí)，C/GP溶液呈半透明狀態(tài)，具有流動(dòng)性：在升溫至37℃后，C/GP溶液變成白色不透明固體狀，失去了流動(dòng)性。溫度的上升造成系統(tǒng)的溶膠/凝膠轉(zhuǎn)變。而隨著殼聚糖與β-甘油磷酸鈉的體積比的變化，C/GP溶液

6、的PH值及37℃凝固時(shí)間亦不同(見(jiàn)附表2)。 3. 接種于C/GP復(fù)合物24h后見(jiàn)細(xì)胞成球狀，未見(jiàn)明顯梭形及多角形細(xì)胞，48h內(nèi)生長(zhǎng)速度較慢，72h后可見(jiàn)梭形，多角形細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。 4. 通過(guò)繪制MSCs生長(zhǎng)曲線，可得出兩條“S”形曲線，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞潛伏適應(yīng)期為第1個(gè)24h，第2～3個(gè)24h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5天后細(xì)胞增殖減慢，6天后細(xì)胞基本停止生長(zhǎng)。而細(xì)胞對(duì)照組的細(xì)胞潛伏適應(yīng)期為第1～2個(gè)24h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期推后至

7、3～5個(gè)24h，1周后細(xì)胞基本停止生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD值無(wú)差異，MSCs在C/GP凝膠(體積比3∶2)中可良好存活、增殖。 結(jié)論：1. MSCs在體外培養(yǎng)條件下具有很強(qiáng)的增殖能力，生長(zhǎng)特性穩(wěn)定。 2. 殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物在室溫狀態(tài)下為液態(tài)，調(diào)整不同體積比37℃凝固時(shí)間可有差別，為溫敏型殼聚糖水凝膠。 3. MSCs在C/GP凝膠(體積比3∶2)中可良好存活、增殖，C/GP凝膠(