溫敏性殼聚糖水凝膠攜帶棕色脂肪干細(xì)胞治療大鼠心梗的研究.pdf

1、急性心肌梗死在我國(guó)的發(fā)病率及死亡率居高不下。AMI引起大量心肌細(xì)胞的壞死及凋亡,導(dǎo)致心臟過度負(fù)荷,從而引起心力衰竭。心臟自身再生能力有限,無法替代流失過多的心肌細(xì)胞。干細(xì)胞是近年來心臟修復(fù)與再生研究的焦點(diǎn),具有自我更新與多向分化潛能。大量的研究證實(shí),干細(xì)胞能夠提高心臟功能,促進(jìn)心肌再生。
　　棕色脂肪來源干細(xì)胞(Brown adipose-derived mesenchymal stem cells,BADSCs)是近年來的一種新

2、的種子細(xì)胞來源,具有高度心肌分化能力,并具有一定的旁分泌潛能,且具有低免疫原性可自體移植等優(yōu)點(diǎn),逐漸被用來研究治療心肌梗死。溫敏性殼聚糖水凝膠是一種優(yōu)良的可注射性支架材料,具有良好的生物相容性與可降解性,已被證實(shí)能夠應(yīng)用于心肌組織工程修復(fù)心肌梗死。
　　本研究首先體外添加殼聚糖產(chǎn)物培養(yǎng)BADSCs,觀察產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞分化的影響并進(jìn)一步探討相關(guān)促分化機(jī)制;并對(duì)BADSCs進(jìn)行Flu-mRFP基因慢病毒轉(zhuǎn)染。在此基礎(chǔ)上,以溫敏性殼聚糖水凝

3、膠作為載體攜帶BADSCs心梗部位移植,檢測(cè)其心梗的修復(fù)能力,并與單純移植的BADSCs在心肌分化能力上進(jìn)行比較驗(yàn)證。
　　本論文主要包括以下三部分內(nèi)容:
　　第一部分:BADSCs體外分離、分選、培養(yǎng)、標(biāo)記及生物學(xué)特性
　　BADSCs主要來源于棕色脂肪組織。通過聯(lián)合酶消化法分離大鼠肩胛骨下脂肪組織,獲得棕色脂肪干細(xì)胞(BADSCs),利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光等技術(shù)對(duì)BADSCs進(jìn)行分選、表型鑒定及成心肌分化鑒定。將

4、攜帶熒光素酶(Fluc)、單體紅色熒光蛋白(mRFP)雙報(bào)告基因的慢病毒轉(zhuǎn)染BADSCs,并鑒定兩種報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果表明:
　　1)流式細(xì)胞儀顯示分選后的BADSCs表達(dá)CD133、CD90、CD34陽(yáng)性,CD45陰性;
　　2)BADSCs能夠自發(fā)心肌分化,免疫熒光鑒定心肌標(biāo)記物陽(yáng)性;
　　3)慢病毒轉(zhuǎn)染后的BADSCs表達(dá)Fluc-mRFP報(bào)告基因。
　　第二部分:溫敏性殼聚糖水凝膠的制備及促心肌分化現(xiàn)象

5、與機(jī)制的研究
　　在培養(yǎng)基中添加殼聚糖降解產(chǎn)物,觀察其產(chǎn)物對(duì)BADSCs心肌分化的影響;并在此基礎(chǔ)上,對(duì)殼聚糖降解產(chǎn)物D-Glu與N-AC-Glu促BADSCs心肌分化作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明D-Glu、N-AC-Glu能夠促進(jìn)BADSCs心肌分化,并通過增加胞外膠原的合成而促進(jìn)這一作用。
　　第三部分:溫敏性殼聚糖水凝膠攜帶BADSCs心梗移植的實(shí)驗(yàn)研究
　　體外制備殼聚糖水凝膠,構(gòu)建大鼠心梗模型,將其隨機(jī)分

6、為4組,PBS組(單純注射PBS100μL)、Chitosan組(單純注射殼聚糖水凝膠100μL)、BADSCs組(注射4×106BADSCs+PBS100μL)、BADSCs+Chitosan組(注射4×106BADSCs+殼聚糖水凝膠100μL)。利用活體生物發(fā)光成像技術(shù)追蹤移植細(xì)胞在大鼠心梗環(huán)境下的滯留與存活情況;心臟超聲及MASSON染色用來評(píng)估心功能的恢復(fù)情況;免疫熒光染色檢測(cè)BADSCs體內(nèi)分化情況,并對(duì)BADSCs組、BA