神經(jīng)型鈣粘附蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及干擾其表達(dá)對腫瘤生物學(xué)行為的影響.pdf

1、食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一,中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家,每年全世界新診斷的30萬食管癌患者中1/2(16.72萬)以上發(fā)生在中國。河南省,特別是河南北部的林州、安陽和輝縣等地,是中國也是世界食管癌發(fā)病率和病死率最高的地區(qū),發(fā)病率高達(dá)478/10萬。由于浸潤、轉(zhuǎn)移是引起食管癌患者死亡的主要因?yàn)?因此對食管癌浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　 鈣粘附蛋白家族(cadherin family)

2、與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其中以上皮型鈣粘附蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)型鈣粘附蛋白(N-cadherin)分布最廣泛。已有研究表明,食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤轉(zhuǎn)移與E-cadherin的低表達(dá)或不表達(dá)有關(guān)。最近研究表明,在前列腺癌、乳腺癌中N-cadherin表達(dá)增多,并且在引起腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移方面有著比E-cadherin減少更為重要的作用。N-cadherin對于腫瘤上皮細(xì)胞及表達(dá)N-cadherin的血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的

3、粘附起著重要的作用。在腫瘤形成過程中,N-cadherin的表達(dá)有助于血管形成及上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞的遷移,從而使腫瘤細(xì)胞更加富于侵襲性,易于轉(zhuǎn)移。此外,N-cadherin還是一種凋亡抑制因子,可以通過抑制凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。
　　 有關(guān)食管鱗狀細(xì)胞癌中N-cadherin的表達(dá)及其與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究,迄今國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 鑒于上述,為深入探討N-cadherin的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌

4、發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,尋求食管鱗狀細(xì)胞癌的早期檢測指標(biāo)及抑制食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移的有效方法,本研究首先對食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管粘膜組織中E-cadherin、N-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,分析兩者與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床諸病理學(xué)因素的關(guān)系；然后運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)(RNA intefforonce。RNAi)沉默N-cadhrin基因在人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EC9706

5、細(xì)胞中的表達(dá),以觀察N-cadherin基因表達(dá)下調(diào)對EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡及體外侵襲力等生物學(xué)行為的影響,同時(shí)檢測干擾前后EC9706細(xì)胞中E-cadherin、MMP-9基因表達(dá)水平的變化；最后通過荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測N-cadherin基因表達(dá)下調(diào)對EC9706細(xì)胞裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長及細(xì)胞凋亡水平的影響,同時(shí)采取免疫組織化學(xué)法和Western blots檢測E-cadhorin、N-cadhcrin和MMP-9在裸

6、鼠體內(nèi)移植瘤中的表達(dá)水平,從而為食管癌侵襲機(jī)制的研究提供新的思路,并為其臨床治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 第一部分E-cadherin和N-cadherin在食管鱗狀細(xì)胞癌中的.表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)法檢測62例食管鱗狀細(xì)胞癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中E-cadherin、N.cadhcrin蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.采用RT-PCR

7、方法檢測62例食管鱗狀細(xì)胞癌組織、31例癌旁不典型增生組織及62例正常食管粘膜組織之中E-cadherin、N-cadherin基因mRNA的表達(dá)情況。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s),兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩個(gè)有序變量之間的相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析,兩分類變量的比較用Poarson'sx2檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果

8、：
　　 1.免疫組織化學(xué)法和RT-PCR聯(lián)合檢測結(jié)果顯示:正常食管粘膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中N-cadherin的蛋白陽性表達(dá)率及mRNA的相對表達(dá)量依次升高,分別為29.0％、61.3％、75.8％和0.154+0.019、0.461±0.024、0.6634±0.016,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而E-cadherin的則依次降低,分別為95.2％、71.0％、40.3％和0.57

9、6±0.043、0.421±0.083、0.259±0.094,組問比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.E-cadherin和N-cadherin的蛋白陽性表達(dá)率及mRNA的相對表達(dá)量與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05),而與患者的性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 3.E-cadherin和N-cadherin在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=0.53

10、4,P<0.05)。
　　 第二部分RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)對EC9706細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響
　　 方法：
　　 1.通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默EC9706細(xì)胞中N-cadherin的表達(dá),運(yùn)用RT-PCR和Western blots檢測RNA干擾效率。
　　 2.運(yùn)用RT-PCR和Western blots檢測RNA干擾前后EC9706細(xì)胞中E-cadherin、MMP-

11、9mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 3.通過Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)對EC9706細(xì)胞體外侵襲力的影響。
　　 4.運(yùn)用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)對EC9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡的影響。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比

12、較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA),RT-PCR和Western blots結(jié)果應(yīng)用Gene Tools進(jìn)行灰度值分析,上述實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)三次。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常對照組和空載體組相比,干擾載體組EC9706細(xì)胞中N-cadherin和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05),而E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)則無明

13、顯變化.(P>0.05)。
　　 2.Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:正常對照組和空載體組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為123.40±8.23、126.00±10.30,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而干擾載體組的穿膜細(xì)胞數(shù)則為49.60±6.80,與以上2組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.MTT法檢測結(jié)果顯示:雖然正常對照組和空載體組相比,EC9706細(xì)胞的生長速率沒有明顯差異(P>

14、0.05),但與以上2組相比,干擾載體組細(xì)胞的生長速率明顯受到抑制,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示；正常對照組的克隆形成率為54.58％±5.54％,空載體組的克隆形成率為57.50％±6.25％,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而干擾載體組的克隆形成率為16.42％±4.86％,與以上2組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:正常對照組和空載體組E

15、C9706細(xì)胞在G0/G1期的比率分別為48.6％±1.43％和50.1％±1.36％,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而干擾載體組EC9706細(xì)胞在G0/G1期的比率高達(dá)76.1％±1.54％,與以上2組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常對照組和空載體組EC9706細(xì)胞的早期凋亡率分別為5.13％±0.71％、5.93％±0.80％,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而干擾載體組的則為26.37％±1.

16、10％,與以上2組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 第三部分荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)對EC9706細(xì)胞裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響
　　 方法：
　　 1.將正常對照組、空載體組和干擾載體組3組EC9706細(xì)胞通過皮下注射的方式接種于裸鼠背部肩胛區(qū),比較各組裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤體終重量及終體積等情況。
　　 2.運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法和Wostorn blot

17、s方法檢測3組裸鼠移植瘤組織中E-cadhcdn、N.cadhorin和MMP-9蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.TUNEL法檢測3組裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞的凋亡水平。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way.ANOVA),Western blots結(jié)果應(yīng)用Gene Tools進(jìn)行灰度值分析,上

18、述實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)三次。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.正常對照組和空載體組裸鼠移植瘤的生長速率、成瘤大小、瘤體終重量和終體積相比較,其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與以上2組相比,干擾載體組裸鼠移植瘤的生長速率、成瘤大小、瘤體終重量和終體積明顯降低,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.正常對照組和空載體組相比,裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和

19、MMP-9蛋白的表達(dá)水平無明顯變化,其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與以上2組相比,干擾載體組裸鼠移植瘤組織中N-cadherin和MMP-9的蛋白表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),而E-cadherin的蛋白表達(dá)則無明顯變化(P>0.05)。
　　 3.干擾載體組(106.81±6.47)裸鼠移植瘤組織中凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加,與正常對照組(51.55±4.68)和空載體組(54.17±5.26)相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

20、P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.-E-cadherin和N-cadherin的蛋白陽性表達(dá)率及mRNA的相對表達(dá)量與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示E-cadherin的低表達(dá)和N-cadherin的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 2.E-cadherin和N-cadhedn在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過

21、程中可能存在著E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)化。
　　 3.RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)能夠抑制EC9706細(xì)胞的增殖,其作用機(jī)制可能是阻滯EC9706細(xì)胞于G0/G1期并誘導(dǎo)其凋亡。
　　 4.RNA干擾沉默N-cadherin表達(dá)可以使EC9706細(xì)胞的體外侵襲力明顯下降,其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)MMP-9的表達(dá),降低細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力,進(jìn)而降低EC9706細(xì)胞的侵襲力。