PLCE1對(duì)食管鱗癌生物學(xué)行為的影響及相關(guān)miRNAs調(diào)控機(jī)制初步研究.pdf

1、第一部分 PLCE1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：探討PLCE1蛋白在不同食管病變組織中的表達(dá)及臨床意義；觀察PLCE1基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞株生物學(xué)功能學(xué)的影響；初步研究 PLCE1基因在食管鱗癌中可能調(diào)控的下游分子和信號(hào)通路。
　　方法：（1）收集石蠟包埋的112例新疆漢族食管鱗癌組織、99例食管鱗癌癌前病變組織（低級(jí)別上皮瘤變60例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變39例）和99例癌旁正常組織，制備組織芯片，應(yīng)用免疫組化檢

2、測(cè) PLCE1蛋白的表達(dá)并分析其與食管鱗癌臨床病理特征及與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系；（2）檢索PubMed，MEDLINE，EMBASE，Web of science，維普，CNKI數(shù)據(jù)庫，收集從建庫至2014年8月期間關(guān)于PLCE1蛋白表達(dá)與食管鱗癌相關(guān)性的文獻(xiàn)，將符合入選標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)按研究方法歸類整理原始數(shù)據(jù)匯總后進(jìn)行Meta分析和統(tǒng)計(jì)處理，分析評(píng)價(jià)PLCE1蛋白與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。（3）用PLCE1特異性的siRNA轉(zhuǎn)

3、染食管鱗癌細(xì)胞系，運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，檢測(cè)不同處理對(duì)凋亡和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)影響；利用transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理下食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力及對(duì)上皮間葉轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)影響，應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的形態(tài)和骨架蛋白F-actin的表達(dá)變化情況；應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞儀觀察并檢測(cè)TNF-α、TRAIL、Paclitaxel、5-FU對(duì)沉默PLCE1基因后的食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)

4、胞增殖抑制及凋亡的變化。（4）應(yīng)用人類表達(dá)譜芯片Affymetrix3’IVT對(duì)不同處理組細(xì)胞進(jìn)行基因芯片分析，篩選出差異表達(dá)基因，并利用生物信息學(xué)進(jìn)行GO分析和KEGG、PATHWAY分析。
　　結(jié)果：（1）PLCE1蛋白的表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞的胞漿，正常組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、食管鱗癌組織中 PLCE1蛋白的高表達(dá)率分別為2.03％（2/99）、58.33%（35/60）、72.50%（28/39）和73

5、.22%（82/112），PLCE1蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織（免疫組化評(píng)分：6.768±0.2717 vs1.707±0.1416，P<0.001），高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(免疫組化評(píng)分：7.103±0.4312 vs1.707±0.1416,P<0.001），低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（免疫組化評(píng)分：6.333±0.3808 vs1.707±0.1416,P<0.001），鱗癌組

6、織中的表達(dá)明顯高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織（免疫組化評(píng)分：6.768±0.2717 vs6.333±0.3808,P=0.046）。（2）PLCE1蛋白表達(dá)與食管鱗癌發(fā)病性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化及浸潤深度等臨床病理特征沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.253,0.309,0.787,0.542,0.418,0.467），但其高表達(dá)與臨床TNM分期（P=0.024）及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（P=0.021）密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)

7、現(xiàn) PLCE1蛋白高表達(dá)與食管鱗癌患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者（log-rank test,χ2=10.243,P=0.001）。用Cox回歸模型進(jìn)行食管鱗癌預(yù)后因素篩選發(fā)現(xiàn)，在包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的多因素分析中，PLCE1蛋白的表達(dá)（HR：8.435，95%CI=1.875-37.983，P=0.005）可以作為獨(dú)立因素影響食管鱗癌患者的預(yù)后因素。（3）在meta分析PLCE1表達(dá)

8、與ESCC臨床病理關(guān)系的研究中，共納入4篇參考文獻(xiàn)（總計(jì)388例食管鱗癌患者，117例正常對(duì)照），結(jié)果顯示PLCE1表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有密切關(guān)系（pooled OR=5.93;95%CI=3.86-9.11），而與腫瘤的浸潤深度（pooled OR=1.54;95%CI=0.84 to2.82）、分化（pooled OR=1.55;95%CI=0.71-3.36）和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（pooled OR=2.83;95%CI=0.89-9.06

9、）無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。（4）轉(zhuǎn)染入PLCE1 siRNA質(zhì)粒后，MTT和單克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示食管鱗癌細(xì)胞的生長受到明顯抑制、食管鱗癌細(xì)胞株的細(xì)胞團(tuán)數(shù)明顯減少，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)過PLCE1siRNA轉(zhuǎn)染的食管鱗癌細(xì)胞株與對(duì)照組相比，早期和晚期凋亡的比率明顯升高（P<0.05），食管鱗癌細(xì)胞株中凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-PARP的表達(dá)量明顯增高。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染PLCE1 siRNA質(zhì)粒的食管鱗癌細(xì)胞株的形

10、態(tài)由原來的長梭形變?yōu)闄E圓形，其侵襲和遷移能力明顯降低；PLCE1基因被干擾后，其上皮的標(biāo)記物E-cadherin明顯升高，而間葉的標(biāo)記物Vimentin則明顯下降。免疫熒光實(shí)驗(yàn)報(bào)告顯示干擾PLCE1表達(dá)后，細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)明顯降低。（5）PLCE1基因被干擾后，食管鱗癌細(xì)胞經(jīng)TNF-α、TRAIL、Paclitaxel、5-FU處理后，其細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡比例明顯增高?？梢?，PLCE1可增加食管鱗癌細(xì)胞對(duì)TNF-α、

11、TRAIL、Paclitaxel和5-FU藥物的抵抗。（6）利用表達(dá)譜芯片篩選轉(zhuǎn)染 PLCE1siRNA人食管鱗癌細(xì)胞前后的差異表達(dá)基因223個(gè)，其中上調(diào)基因168個(gè)，下調(diào)基因55個(gè)，這些基因主要涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白酶活性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等方面，涉及的通路有 MAPK通路，粘著斑形成，Axon guidance，p53通路，Starch and sucrose metabolism，ECM-receptor inte

12、raction，Toll樣受體信號(hào)通路，D-Glutamine and D-glutamate metabolism，Cytokine-cytokine receptor interaction，Glutamate metabolism等。
　　結(jié)論：（1）PLCE1在食管鱗癌及癌前病變組織中的表達(dá)明顯高于正常組織的表達(dá)，其高表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后差密切相關(guān)且是影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素；（2）PLCE1不但可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞

13、的增殖并抑制其凋亡，還可以增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子和化療藥物的耐藥性，且其可以通過影響骨架蛋白表達(dá)及上皮間葉轉(zhuǎn)化來調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：（1）闡明miR-145靶向調(diào)控PLCE1表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；（2）篩選并探討PLCE1在食管鱗癌中可以調(diào)控的miRNA及其下游靶基因在食管鱗癌發(fā)生中的作用機(jī)制。
　　方法：（1）運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可能靶向調(diào)控PLCE1的miRNAs，應(yīng)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

14、驗(yàn)證PLCE1是miR-145的靶基因，觀察miR-145通過調(diào)控PLCE1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食管鱗癌組織及其正常食管組織中miR-145和PLCE1的表達(dá)情況，分析它們之間的相關(guān)性。（2）運(yùn)用Affymetrix
　　GeneChip? miRNA3.0 Arrays芯片來篩選PLCE1基因可能調(diào)控的下游miRNAs分子并進(jìn)行驗(yàn)證。（3）對(duì)驗(yàn)證得出的miR-106b分子在食管鱗癌細(xì)胞中進(jìn)行生物

15、功能學(xué)的研究；應(yīng)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RBL1和RBL2是miR-106b的靶基因；觀察PLCE1通過調(diào)控miR-106b以及靶基因進(jìn)而對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。（4）應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食管鱗癌組織和正常食管組織中miR-106b的表達(dá)，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)368例食管鱗癌組織和215例正常食管組織中RBL2蛋白的表達(dá)情況，并聯(lián)合分析PLCE1蛋白、miR-106b和RBL2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：（1）運(yùn)用生物信息學(xué)

16、軟件進(jìn)行對(duì)可能靶向調(diào)控PLCE1基因的miRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-145為三個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)的分子。通過在食管鱗癌細(xì)胞系中檢測(cè)兩者的表達(dá)情況，初步確認(rèn)PLCE1與miR-145可能存在一定的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。通過轉(zhuǎn)染miR-145mimcs和inhibitor對(duì)PLCE1表達(dá)的調(diào)控作用以及應(yīng)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌細(xì)胞系中miR-145可靶向調(diào)控PLCE1的表達(dá)。（2）miR-145可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)食

17、管鱗癌細(xì)胞的凋亡，并可通過調(diào)控細(xì)胞的骨架從而抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力，增強(qiáng)miR-145表達(dá)且轉(zhuǎn)染PLCE1 siRNA介導(dǎo)的PLCE1基因沉默能更加顯著的降低食管鱗癌的增殖和侵襲能力。（3）與癌旁正常食管組織相比，miR-145在癌組織中表達(dá)顯著降低（癌組織41.92±9.089，正常組織104.4±13.00，P=0.0002），miR-145的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0：66.54±32.47，N1-3：25.89±9.95，P=0

18、.0002）和臨床分期密切相關(guān)（T1/2：54.01±21.86，T3/4：31.03±15.77，P=0.0381）。食管鱗癌組織樣本中miR-145 mRNA表達(dá)與PLCE1蛋白存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.472，P=0.008）。（4）運(yùn)用Affymetrix GeneChip? miRNA3.0 Arrays芯片檢測(cè)PLCE1可能調(diào)控的miRNAs分子，我們發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p和miR-93可被PLCE1顯著上調(diào)。通

19、過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在沉默PLCE1后，miR-106b和miR-93表達(dá)顯著下調(diào)，初步在食管鱗癌細(xì)胞中確認(rèn)PLCE1與miR-106b和miR-93存在顯著的正向調(diào)控關(guān)系。（5）miR-106b可顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。初步驗(yàn)證得出RBL2和RBL1為miR-106b的靶基因。增強(qiáng)miR-106b表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)siRNA介導(dǎo)的PLCE1基因沉默導(dǎo)致的食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲能力降低，并且也部分逆轉(zhuǎn)P

20、LCE1基因沉默導(dǎo)致的食管鱗癌細(xì)胞凋亡增加。（6）與正常食管組織相比，miR-106b-5p在癌組織中表達(dá)顯著增高（P=0.0211），RBL2在癌組織中表達(dá)顯著降低（P<0.0001）。食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達(dá)與miR-106b表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（R=0.4814，P=0.0431），食管鱗癌組織樣本中PLCE1蛋白表達(dá)與RBL2蛋白表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（R=-0.2934，P=0.0015），食管鱗癌組織樣本中mi