miRNA干擾FASN表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建和篩選沉默F(xiàn)ASN基因的最佳重組質(zhì)粒，探討下調(diào)FASN基因表達(dá)對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS細(xì)胞體外增殖、侵襲、遷移能力的影響。
　　方法:
　　①根據(jù)NCBI查詢到的FASN cDNA序列設(shè)計(jì)并合成靶向FASN的寡聚核苷酸序列，連接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒(分別命名為X197-1、2、3、4)。重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀

2、察熒光率。RT-PCR和Western blot檢測(cè)構(gòu)建的重組質(zhì)粒對(duì)FASN的mRNA及蛋白表達(dá)的影響。
　?、趦?yōu)化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件，以優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件((plasmid: Lipofectamine2000=1∶3))轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，劃痕愈合和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷徙能力。
　　結(jié)果:
　?、俪晒?gòu)建質(zhì)粒，其中質(zhì)粒(X197-1、X197-2)轉(zhuǎn)染U2-OS骨肉瘤細(xì)

3、胞的熒光率大于50％。四質(zhì)粒均能有效抑制FASN mRNA(53.2±4％、47.5±3％、41.9±5％、52.8±2)％及FASN蛋白的表達(dá)(抑制率:79.4％、47.3％、64.5％、64.2％)。同其他質(zhì)粒相比，X197-1被篩為最佳質(zhì)粒。
　?、贛TT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染X197-1質(zhì)粒的細(xì)胞在24h、48h、72h、96h的OD值分別為（0.1183±0.0408、0.1567±0.0476、0.3033±0.0121、0.47

4、83±0.0107），明顯低于陰性對(duì)照組和空白組(p＜0.05)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果示轉(zhuǎn)染X197-1質(zhì)粒的細(xì)胞遷移率(13.7±8.7％)明顯低于陰性對(duì)照組(74.8±4.5％)和空白組(77.6±6.4％)(p＜0.05)。Transwell侵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染X197-1質(zhì)粒的細(xì)胞穿膜數(shù)（55±4.8）個(gè)明顯少于少于陰性對(duì)照質(zhì)粒組(135±7.4)個(gè)和空白組(146±6.7)個(gè)(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)表明構(gòu)建的干擾質(zhì)粒沉默F(xiàn)ASN基