玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析.pdf

1、該論文在系統(tǒng)研究MAPK途徑在玉米大斑病菌生長(zhǎng)、發(fā)育、侵染和毒素產(chǎn)生等方面調(diào)控作用的基礎(chǔ)上,獲得了115個(gè)MAPK途徑調(diào)控基因的表達(dá)基因片段,并克隆了1個(gè)玉米大斑病菌MAPK基因----STKl基因.1、建立了一套切實(shí)可行的檢測(cè)MAPK活性的熒光素酶/熒光素技術(shù)體系,并發(fā)現(xiàn)MAPK途徑抑制劑U0126和CaM抑制劑TFP對(duì)MAPK活性都有顯著的抑制作用.2、玉米大斑病菌的分生孢子的水懸浮液和PD懸浮液在玻璃平板上12h以內(nèi)、在玉米葉片的

2、上表面和下表面24h以內(nèi)都可以產(chǎn)生成熟的附著胞,在葉片上附著胞和侵入絲的產(chǎn)生時(shí)間晚于玻璃平板,產(chǎn)生數(shù)量也少于玻璃平板.3、在PDA培養(yǎng)基上,U0126對(duì)玉米大斑病菌、玉米黃斑病菌、小麥根腐病菌等10種植物病原真菌的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒有顯著影響,可以形成正常的菌絲、分生孢子,但U0126處理的玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)時(shí)間晚,芽管短,分生孢子的萌發(fā)百分率下降.4、U0126和TFP單獨(dú)或混合處理對(duì)玉米大斑病菌附著胞產(chǎn)生都有一定的抑制作用,

3、抑制作用隨著濃度增而增強(qiáng),隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而減弱.但加入cAMP后,它們的抑制作用消失,從而表明,MAPK途徑與Ca<'2+>-CaM途徑和cAMP途徑間即有協(xié)同作用,又相互影響,它們之間組成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控玉米大斑病菌的分生孢子和附著胞發(fā)育.5、U0126處理后,玉米大斑病菌HT-毒素的組成及活性都發(fā)生了變化,部分組分的產(chǎn)生受到了抑制,并誘導(dǎo)產(chǎn)生了一些新的毒素組分.抑制劑濃度不同,新組分的種類和含量不同.6、在含有少量離子的蒸餾水

4、中,U0126對(duì)菌絲的細(xì)胞膜透性和PAL活性沒有顯著影響,但POD和PPO活性變化明顯,推測(cè)U0126對(duì)病菌細(xì)胞可能沒有直接的毒害作用,而與病菌的活性氧代謝有關(guān).8、利用DDRT-PCR和反式Northern雜交技術(shù),獲得了115條特異于U0126處理的差異表達(dá)基因片段,對(duì)4個(gè)差別表達(dá)基因片段進(jìn)行克隆并測(cè)序,獲得了長(zhǎng)度分別為296bp、333bp、479bp和601bp的4條cDNA序列.9、利用巢式PCR和RACE技術(shù)獲得了1個(gè)玉米大

5、斑病菌MAPK同源基因-STKl基因的cDNA序列、部分基囚組序列及其兩側(cè)序列,在基因內(nèi)部存在3個(gè)內(nèi)含子.該基因含有MAPK、Ser/Thr蛋白激酶、JNK(Jun-N-terminal kinase)等同源結(jié)構(gòu)域,與許多真菌和動(dòng)物中與應(yīng)激反應(yīng)和致病性有關(guān)的MAPK蛋白有較近的親緣關(guān)系和較高的同源性,在基因組中主要以單拷貝形式存在,發(fā)現(xiàn)多數(shù)供試菌株中都含有STK1基因,但菌株間既具有較強(qiáng)的保守性,又存在一定的序列差異.10、30μM U