應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制雞傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是危害雛雞的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病，給世界范圍的養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。病原為雞傳染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal DiseaseVirus IBDV)，IBDV對(duì)宿主淋巴細(xì)胞有嚴(yán)格嗜性，其RNA基因組易變異，常規(guī)的疫苗設(shè)計(jì)策略難以產(chǎn)生理想的免疫效果，因此，探索防治該病的新方法有重要意義。 RNA干擾(RNA inte

2、rference，RNAi)作為新的有效抗病毒工具，其機(jī)制與建立在病毒蛋白基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)的疫苗免疫機(jī)制不同，是轉(zhuǎn)錄后mRNA水平上的基因沉默機(jī)制，通過雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子阻斷或者降低同源基因的表達(dá)而達(dá)到抗病毒復(fù)制的效果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，21～23nt的小干擾dsRNA(small interfering RNA，siRNA)可以誘導(dǎo)同源基因特異表達(dá)抑制，為探索抗病毒研究提供了新思路。

3、 本研究針對(duì)IBDV中RNA聚合酶(VPl)的編碼基因、主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3的編碼基因，使用http：//www．a(chǎn)mbion.com的靶位點(diǎn)篩選和設(shè)計(jì)工具，分別選取3個(gè)特異siRNA序列(VPI：siRNA618、siRNA1115和siRNA2571，VP2：siRNA989、siRNA1143和siRNA1311，VP3：siRNA222、siRNA314和siRNA448)，同時(shí)設(shè)計(jì)無(wú)相關(guān)序列(siRNA-CON)對(duì)照

4、，利用體外轉(zhuǎn)錄法產(chǎn)生siRNA。VPl-siRNA、VP2-siRNA、VP3-siRNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后感染IBDV，通過病毒蝕斑和熒光定量PCR法檢測(cè)VPl-siRNA對(duì)IBDV復(fù)制的抑制效果。VP2-siRNA、VP3-siRNA與表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的重組質(zhì)粒pEGFP-VP2、pEGFP-VP3共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，熒光顯微鏡下檢測(cè)表達(dá)GFP蛋白細(xì)胞比例，快速篩選有效V