傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征、表達(dá)與應(yīng)用.pdf

1、傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的以侵害雛雞淋巴組織，特別是中樞免疫器官-法氏囊為主要特征的傳染病。該病不僅引起患病動(dòng)物死亡，而且還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗，對(duì)易感雞群實(shí)施疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法，但由于各地流行的IBDV毒株的毒力與抗原性的差異，給疫

2、苗毒株的選擇造成較大的困難，每年由于IBD免疫失敗或免疫抑制造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。為了抵抗超強(qiáng)毒的攻擊以及母源抗體的干擾，目前廣泛應(yīng)用中等毒力的IBD活疫苗，給IBD的防控帶來(lái)極大的隱患，滅活疫苗存在著抗原制備的困難。鑒于此，進(jìn)一步分析當(dāng)前IBDV的分子流行病學(xué)、研制新型的基因工程疫苗，仍是當(dāng)前禽病防控工作中亟待解決的重要課題。本文對(duì)近期流行毒株IBDV的主要保護(hù)性抗原VP2基因的分子特征進(jìn)行了分析，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組VP2蛋

3、白，并進(jìn)行了初步應(yīng)用研究，為IBDV的診斷和防控提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)部分：
　　 實(shí)驗(yàn)1：近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征
　　 用RT-PCR方法從2007年12月在安徽境內(nèi)發(fā)生的兩起傳染性法氏囊病（IBD）免疫預(yù)防失敗的病雞法氏囊組織AH1與AH2中擴(kuò)增傳染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2基因。序列分析，AH1與AH2病毒VP2基因長(zhǎng)度均為1350nt，編碼450aa，七

4、肽基序均為SWSASGS，在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別是A、Q、I、D、A、I和S，具有IBDV強(qiáng)毒的分子特征，用AH1和AH2感染20日齡雛雞，產(chǎn)生明顯IBD病變，死亡率為25％（1/4）。同源性分析，26個(gè)血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為90.7％～99.6％和95.5％～100.0％，其中，15個(gè)中國(guó)IBDV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別在97.5％

5、～99.7％、98.6％～100.0％，血清Ⅰ和Ⅱ型IBDV毒株之間核苷酸和氨基酸序列的同源性則分別小于78.6％和83.0％。不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸殘基以及高變區(qū)的親水性有差異。在進(jìn)化樹(shù)上，26個(gè)血清Ⅰ型IIBDV毒株可分為數(shù)組，其中的15個(gè)中國(guó)分離IBDV毒株不在同組，毒株之間的親緣關(guān)系與分離地區(qū)或分離時(shí)間沒(méi)有明顯的聯(lián)系。AH1和AH2與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列差異率分別為5.3％和5

6、.2％；氨基酸序列差異率分別為4.0％和3.4％，這也進(jìn)一步佐證了IBDV野毒VP2基因變異所引起的毒力變化和VP2抗原表位的漂移是導(dǎo)致當(dāng)前IBD疫苗免疫預(yù)防失敗的主要原因。本文對(duì)認(rèn)識(shí)當(dāng)前IBDV的流行和變異現(xiàn)狀具有參考價(jià)值，為新型IBDV野毒致病性和變異簡(jiǎn)便定性檢測(cè)方法探索了一條新途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)2：傳染性法氏囊病病毒VP2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)
　　 將2007年12月從安徽境內(nèi)發(fā)生的IBD免疫預(yù)防失敗的病雞法氏囊

7、組織中克隆的IBDV VP2基因插入到pFastBac1供體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)三抗性篩選，獲得重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBac-VP2，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。對(duì)rBac-VP2感染的Sf9細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)，具有特異性熒光；用免疫印跡（Western-blotting）分析，在50 kD處出現(xiàn)一條特異蛋白條帶；電鏡觀察，重組VP2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒。本實(shí)驗(yàn)為研制針對(duì)近期流行

8、IBDV的新型病毒樣顆粒疫苗和新型檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)3：傳染性法氏囊病病毒VP2基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的融合表達(dá)與應(yīng)用
　　 將2007年12月從安徽境內(nèi)發(fā)生的IBD免疫預(yù)防失敗的病雞法氏囊組織中克隆的IBDV VP2基因定向克隆入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2，轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)，篩選重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacA-VP2。

9、用rBacA-VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。對(duì)重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢測(cè)，具有特異性熒光；用IBDV抗體夾心ELISA檢測(cè)，呈陽(yáng)性反應(yīng)，抗原效價(jià)達(dá)到102；用免疫印跡（Western-blotting）分析，在53 kD處出現(xiàn)一條特異蛋白條帶；電鏡觀察，重組VP2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒。用HisTrap HP親和層析柱純化的重組VP2蛋白作為包被抗原，建立了IBDV抗體間接ELISA