雞傳染性法氏囊病病毒基因突變及缺失重組的研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒IBDV(infectiousbursaldiseasevirus)引起，是危害雞的一種急性、高度接觸性傳染病。近年世界各地出現(xiàn)了超強毒IBDV(vvIBDV)，它的毒力遠大于經(jīng)典毒株，但是這種毒力增強的分子基礎(chǔ)尚不完全清楚。IBDV基因組包括A節(jié)段和B節(jié)段，A節(jié)段編碼所有的結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3、VP4和非結(jié)構(gòu)蛋白VP5，B節(jié)段編碼RNA聚合酶。VP2是主要的宿主保護性抗原，并與病毒毒

2、力和細胞的嗜性密切相關(guān)，其毒力相關(guān)的控制位點主要位于VP2高變區(qū)的253、284位的氨基酸。但不同毒株的VP2高變區(qū)對毒力控制的表現(xiàn)有較大的差別，有的毒株毒力不由VP2高變區(qū)控制，說明還有別的區(qū)域控制。VP3是群特異性抗原，具有一定的免疫保護性，其羧基端與毒力有關(guān)，但是在不同的毒株表現(xiàn)怎樣尚不得知。為探討VP2高變區(qū)和VP3對IBDV毒力的影響，本文采用融合PCR，將超強毒Harbin-1的A節(jié)段和B節(jié)段各自的編碼區(qū)(CR)和非編碼區(qū)(

3、NCR)進行連接，得到全長的基因組。同時，為了轉(zhuǎn)錄的需要，在5′端引入T7啟動子序列，連入載體pMD-18-T-simple，得到的A節(jié)段克隆命名為pMD-18-HA(RHA)，B節(jié)段的克隆為pMD-18-HB(RHB)。在此基礎(chǔ)上運用點突變將VP2高變區(qū)的253、284氨基酸位點同時突變，而對VP3的783、862、921氨基酸位點進行兩點突變的組合，共得到4個含有雙點突變組合的A節(jié)段。采用cRNA介導(dǎo)的反向遺傳技術(shù)將A節(jié)段和B節(jié)段共

4、轉(zhuǎn)染法氏囊原代細胞(CEB)，用AC-ELISA篩選出4個突變的病毒，H253/284、H783/862、H862/921、H921/783通過CEF細胞培養(yǎng)實驗和免疫熒光檢測說明253、284突變未能改變細胞的嗜性，而783、862、921突變卻都能改變細胞的嗜性，說明控制細胞的嗜性除由VP2控制外還有VP3。然后用相同滴度的病毒接種四周齡SPF雞，測定其毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個突變病毒對SPF雞致死率和法氏囊病理變化有較大的差異。H921

5、/783病毒組毒力最低，它不致死雞，法氏囊病理變化也最輕微，僅間質(zhì)增寬；H862/921、H253/284病毒毒力次之；H783/862病毒毒力較強，SPF雞致死率高達5/8，法氏囊壞死并嚴重萎縮。以上結(jié)果表明，VP2高變區(qū)253、284和VP3的862、921氨基酸位點是毒力控制的決定因素，但是VP3控制毒力的能力強于VP2高變區(qū)。 另一方面，為了進一步說明超強毒株毒力增強和非編碼區(qū)的關(guān)系，運用PCR法將Harbin-1的A節(jié)

6、段5’非編碼區(qū)(NCR)進行順式缺失和以及和弱毒Cj801之間NCR的替換，得到缺失35(啟動子區(qū))、74(啟動子和IRES區(qū))、94(IRES區(qū))堿基的突變體和嵌合體(CA)，再次運用采用cRNA介導(dǎo)的反向遺傳技術(shù)轉(zhuǎn)染法氏囊原代細胞，用AC-ELISA法篩選出4個突變的病毒，分別命名為H△35、H△74、H△94、Hca，并通過免疫熒光得到了驗證。隨后用流式細胞計數(shù)儀進行重組病毒對CEB細胞凋亡的研究。結(jié)果表明，重組病毒均能誘導(dǎo)原代法

7、氏囊細胞(CEB)的凋亡，隨著缺失長度的增加，病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力也隨之減弱(缺失74堿基的例外)，非編碼區(qū)替換的病毒和野生病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的能力沒有差別。以上結(jié)果表明，Harbin-1的A節(jié)段5，NCR的啟動子區(qū)和IRES區(qū)有增強細胞調(diào)亡的能力，啟動子區(qū)和IRES區(qū)之間的區(qū)域可抑制細胞凋亡。 為了檢測以上各個重組病毒的病毒復(fù)制速率，進行了定量PCR檢測病毒復(fù)制，結(jié)果表明①5’NCR缺失和替換的重組病毒復(fù)制速率低于野生毒株，非