多西環(huán)素抑制惡性黑色素瘤小鼠移植瘤模型的初步實驗研究.pdf

1、目的：通過惡性黑色素瘤小鼠移植瘤模型給藥實驗，從病理形態(tài)學和分子水平研究多西環(huán)素對惡性黑色素瘤微循環(huán)模式和增殖活性的影響，初步闡明該藥對惡性黑色素瘤的作用及其機制，進而為探索惡性黑色素瘤治療新途徑提供實驗依據(jù)。 方法：C57小鼠47只，隨機分為給藥組和對照組，鼠鼷部注射黑色素瘤B16細胞懸液建立荷瘤小鼠模型。待小鼠出現(xiàn)可觸及腫塊后開始給藥，給藥組每日腹腔注射鹽酸多西環(huán)素，對照組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥7天后處死給藥組和對照組小

2、鼠各10只。繼續(xù)給藥實驗14天后處死剩余小鼠，剝離瘤塊并稱重，取少量無壞死的新鮮腫瘤組織-80℃凍存。將剩余腫瘤組織沿最大面剖開，常規(guī)固定并進行HE和PAS染色，進行形態(tài)學觀察。免疫組化染色觀察藥物對MMP-2、MMP-9、VEGF、PCNA表達的影響。計數(shù)方法如下：避開壞死組織，選擇有代表性的10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，使用陽性細胞指數(shù)來評價整張切片的染色狀況。從凍存的新鮮腫瘤組織提取總蛋白，用明膠酶譜法檢測給藥組和

3、對照組腫瘤組織在兩個時間點中MMP-9、MMP-2酶原(pro-MMP-2)、活性MMP-2(actived-MMP-2)的活性變化，以觀察該藥對MMP-2、MMP-9活性的影響。腫瘤微循環(huán)模式計數(shù)方法如下：隨機選擇10個高倍視野，結(jié)合PAS染色進行內(nèi)皮依賴性血管、VM計數(shù)并取均值，觀察多西環(huán)素對腫瘤微循環(huán)的影響。使用統(tǒng)計學軟件包SPSS進行析因設計的方差分析比較各組間均數(shù)差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義標準。 結(jié)果：多西環(huán)素

4、給藥組小鼠腫瘤生長速度始終低于對照組，初期抑瘤效果比較顯著，但后期抑瘤作用有所降低，給藥7天抑瘤率為52.36％，給藥14天抑瘤率降為35.63％。明膠酶譜法分析顯示，給藥組的MMP-9和活性MMP-2的條帶酶解量以及活性MMP-2與MMP-2酶原比值均低于對照組(P＜0.01)，但兩組間MMP-2酶原條帶酶解量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，給藥7天后，給藥組的MMP-2、MMP-9表達均低于對照組(P＜0.01，

5、P＜0.05)；給藥組VEGF表達高于對照組(P＜0.05)；給藥組的內(nèi)皮依賴性血管和VM密度均低于對照組(P＜0.01，P＜0.05)。給藥14天后，給藥組MMP-2、MMP-9的表達均低于對照組(P＜0.01，P＜0.01)；給藥組VEGF表達高于對照組(P＜0.05)；給藥組的內(nèi)皮依賴性血管密度低于對照組(P＜0.01)，但兩組間血管生成擬態(tài)密度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。另外，給藥7天后兩組間PCNA的表達水平無統(tǒng)計學差異

6、(P＞0.05)，但給藥14天后給藥組PCNA的表達水平低于對照組(P＜0.05)。 結(jié)論：多西環(huán)素可以抑制惡性黑色素瘤小鼠移植瘤的生長，其作用機制主要包括以下兩方面：(1)該藥可抑制MMP-2、MMP-9的表達和活性，在腫瘤發(fā)展早期階段該藥對黑色素瘤的內(nèi)皮依賴性血管和VM密度均有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用。但在腫瘤發(fā)展后期，該藥僅對內(nèi)皮依賴性血管有抑制作用，而對VM的抑制作用基本消失，抑瘤作用有所降低。其原因可能為

7、腫瘤發(fā)展后期缺氧壓力不斷增大促使腫瘤細胞啟動不依賴MMP-2的信號轉(zhuǎn)導通路形成VM；此外，具有胚胎樣基因表型的惡性黑色素瘤細胞在缺氧壓力增大時可能會提高自身的可塑性，提高VM形成能力，這在一定程度上抵消了多西環(huán)素對VM的抑制作用。本研究中腫瘤發(fā)展后期多西環(huán)素不能有效抑制VM而造成抑瘤作用降低的結(jié)論，在一定程度上解釋了目前單純靶向內(nèi)皮依賴性血管的抗血管生成療法效果不理想的原因。(2)該藥對腫瘤細胞增殖周期的影響需要作用一定的時間才能顯現(xiàn)，