IL-24基因治療小鼠黑色素瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-24基因在小鼠黑色素瘤移植瘤體內(nèi)的表達(dá)及其對黑色素瘤的抑制作用。
　　方法：
　　1. B16細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐里取出并復(fù)蘇B16細(xì)胞，接種于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，傳代。
　　2.黑色素瘤B16細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型的建立待觀察C57BL/6小鼠一周后，一般狀況良好的情況下，收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，在無菌條件下每只以5×106cells

2、/ml接種于小鼠背部皮下，觀察小鼠移植瘤的生長情況。
　　3. IL-24基因治療黑色素瘤B16細(xì)胞小鼠移植瘤的影響將荷瘤鼠隨機(jī)分為3組，每組6只,在瘤體內(nèi)注射脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-24（10μg）為實(shí)驗(yàn)組,注射脂質(zhì)體包裹的空載質(zhì)粒 pEGFP-N1（10μg）、注射PBS（0.2ml）為陰性對照組。每3天注射一次，共注射4次。每次注射藥物前先用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W）,計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫

3、瘤的生長曲線。
　　4.在末次注射藥物后7天斷頸處死小鼠，剝離腫瘤組織。小部分組織冰凍用于RT-PCR鑒定，剩余部分組織冰凍用于Western蛋白印跡法檢測Bax蛋白的表達(dá)。
　　5. RT-PCR方法檢測移植瘤組織中IL-24 mRNA的表達(dá)從各組移植瘤組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，與IL-24上下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并查看目的條帶
　　6. Western蛋白印跡法檢測移植

4、瘤組織中的Bax蛋白的表達(dá)提取各組移植瘤組織中的蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗體與目的蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，顯影、定影后，觀察目的蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了黑色素瘤移植瘤小鼠模型，接種細(xì)胞后第12天小鼠皮下腫瘤直徑均達(dá)5mm，腫瘤移植率達(dá)100％；
　　2.腫瘤生長曲線圖表明重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-IL-24組移植瘤的體積明顯小于空載質(zhì)粒pEGFP-N1組和PBS組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義(P<0.05)，而空載質(zhì)粒組和PBS組移植瘤體積則無明顯差異(P>0.05)。與空載質(zhì)粒pEGFP-N1組和PBS組相比，重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-24組移植瘤生長緩慢，而空載質(zhì)粒pEGFP-N1組和PBS組移植瘤生長曲線幾乎平行；
　　3.各組的腫瘤組織中提取了 RNA,進(jìn)行 RT-PCR檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-24組在611bp處有一陽性條帶而空載質(zhì)粒pEGFP-N1組和PB

6、S組未出現(xiàn)此預(yù)期的條帶；
　　4.各組移植瘤組織中提取蛋白進(jìn)行 Western蛋白印記法，結(jié)果在重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-24組上出現(xiàn)了Bax蛋白的表達(dá),而空載質(zhì)粒pEGFP-N1組和PBS組未出現(xiàn)Bax蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. IL-24基因在黑色素瘤組織中穩(wěn)定表達(dá)了其蛋白。
　　2. IL-24具有抑制黑色素瘤B16細(xì)胞小鼠移植瘤生長的作用。
　　3. IL-24對黑色素瘤組織有促進(jìn)Ba