酸棗仁皂苷A生物吸收的細(xì)胞學(xué)機制.pdf

1、通過試驗觀察人結(jié)腸癌細(xì)胞(the human colon carcinoma cell line,Caco-2)對酸棗仁皂苷A(JujubosideA，JuA)攝取與轉(zhuǎn)運過程，探明JuA在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特性，為深入研究JuA的藥理學(xué)作用機制提供理論和試驗依據(jù)。 方法 ①建立并采用高效液相(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)方法檢測JuA的濃度，評價Caco-2

2、細(xì)胞吸收J(rèn)uA的能力。 ②建立與評估Caco-2細(xì)胞模型，由于Caco-2細(xì)胞來源和培養(yǎng)條件差異，不同克隆Caco-2細(xì)胞之間增殖和生化特性不盡相同。即使在相同的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞模型的某些生物物理和生化特征也會有一定的差異，所以各實驗間的數(shù)據(jù)只具參考價值，不可直接套用。因此本實驗室在Caco-2細(xì)胞模型建立之初對一些參數(shù)如光鏡檢查，電鏡檢查，跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistanc

3、e，TEER)，葡聚糖的通透性等指標(biāo)進行測定，以確證單層Caco-2細(xì)胞模型的特異性。 ③通過MTT法了解不同濃度的JuA對Caco-2細(xì)胞的毒性作用。 ④繪制培養(yǎng)時間．細(xì)胞藥物攝取量曲線，考察時間對Caco-2細(xì)胞攝取JuA的影響，并同時考察pH、濃度及溫度對Caco-2細(xì)胞攝取JuA的影響。 ⑤研究P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)抑制劑維拉帕米(Verapamil，Ver)及代謝抑制劑疊氮

4、化鈉(Sodium azide)，2,4-二硝基酚(2,4-Dinitrophenol)對Caco-2細(xì)胞攝取JuA的影響，探討JuA的吸收機制。 ⑥Caco-2細(xì)胞在Transwell上培養(yǎng)21天后，分別在頂側(cè)(Apical，AP)和基底側(cè)(Basolateral，BL)加入100μg·ml<,-1>的JuA，通過表觀通透系數(shù)(Apparent permeability coefficient，Papp)的測定來探導(dǎo)JuA的轉(zhuǎn)

5、運機制。 結(jié)果①JuA高效液相的檢測方法為波長：210 nm；流動相：乙腈：O.01 m01·L<'-1>KH<,2>PO<,4>(pH=3.5)=35：65；流速：1.0 ml·min<'-1>，靈敏度：0.01AUFS。②Caco-2細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板及Transwell上分別培養(yǎng)14天及21天后形成完整的單層細(xì)胞模型。③JuA在12.5-200μg·ml<'-1>。范圍內(nèi)Caco-2細(xì)胞存活率大于80％。④Caco-2細(xì)胞

6、攝取JuA(100μg·ml<'-1>)呈時間依賴性，JuA在120 min時攝取達(dá)穩(wěn)態(tài)；Caco-2細(xì)胞對JuA(25-100μg·ml<'-1>)的攝取呈濃度依賴性；Caco-2細(xì)胞分別在40℃，37℃條件下培養(yǎng)2h后其對JuA(100μg·ml<'-1>)的攝取量分別為14.54±O.65、20.03±1.83 ng·μg<'-1>～protein，有統(tǒng)計學(xué)意義(*P

7、、8.0的介質(zhì)下培養(yǎng)2h后其對JuA(100 μg·ml<'-1>)的攝取量分別為22.224±1.49、20.31±1.34、20.71±1.1 7、20.11±1.07ng·μg<'-1>protein。4個試驗組的總體均數(shù)相等(P>O.05)；因此Caco-2細(xì)胞攝取實驗的適宜培養(yǎng)時間和濃度為120 min、JuAl00 μg·m1<'-1>。⑤P-gp抑制劑Ver(49μg·ml<'-1>)對Caco-2細(xì)胞攝取JuA無影響(P

8、>0.05)；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ抑制劑疊氮化鈉(650μg·ml<'-1>)及解偶聯(lián)劑2，4-二硝基酚(92μg·ml<'-1>)對Caco-2細(xì)胞攝取100μg·ml<'-1>JuA有抑制作用(*p，BL-AP側(cè)的Papp為6.85±0.52E-06cm·sec<'-1>，兩組均數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O.05)。 結(jié)論①我們建立

9、的JuA高效液相檢測方法穩(wěn)定、靈敏、準(zhǔn)確、可靠，為定量研究JuA提供了可靠的技術(shù)保障。②在本室條件下培養(yǎng)建立的Caco-2細(xì)胞模型，在形態(tài)上與小腸上皮細(xì)胞相似；跨膜電阻大于600Ω·cm<'2>；葡聚糖不能透過細(xì)胞膜。符合Caco-2細(xì)胞的特征，可以作為考察藥物小腸吸收轉(zhuǎn)運的體外細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?。③JuA的攝取存在時間依賴性，前60min近似成線性，達(dá)峰時間120 min，峰濃度為22.84±1.98ng·μg<'-l>protein；在2

10、5-100μg·ml<'-1>范圍內(nèi)，JuA的攝取存在濃度依賴性，無飽和現(xiàn)象，符合被動擴散特點，可能存在被動擴散。JuA的攝取量可被能量代謝抑制劑所抑制，呈現(xiàn)主動轉(zhuǎn)運的特點，且BL-AP側(cè)的Papp值與AP-BL側(cè)Papp值的比值為1.28介于1與1.5之間，故JuA的細(xì)胞攝取機制可能是被動轉(zhuǎn)運與主動轉(zhuǎn)運共同參與的過程。④JuA的攝取不受P-gp抑制劑Ver的影響，提示JuA可能不是P-gp的底物。⑤JuA的AP-BL側(cè)的Papp為5.