IGF-1R對食管鱗癌生物學(xué)行為的影響及患者IGF-1、IGFBP-3與化療療效的關(guān)系.pdf

1、食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。由于早期診斷率低,大部分患者就診時已是晚期,失去了手術(shù)機(jī)會。以化療為主的綜合治療成為中晚期食管癌患者的主要治療手段。但化療選擇性差,在殺傷腫瘤細(xì)胞同時也損傷了正常細(xì)胞,其嚴(yán)重的不良反應(yīng)和腫瘤對化療藥物的抵抗常使臨床治療無法取得滿意的療效。
　　 尋找腫瘤發(fā)展過程中的有效靶點,研制有效的靶向治療藥物,抑制腫瘤生長,促使腫瘤消退,是近些年來腫瘤研究的熱點。靶向治療不僅可以有效地在分子水平上阻斷腫瘤生長的

2、信號通路,還可以避免化療引起的不良反應(yīng),為攻克腫瘤這一難治疾病帶來了希望。
　　 胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)是一種跨膜的具有酪氨酸激酶活性的蛋白受體。當(dāng)IGF-1R與配體IGF-1或IGF-2結(jié)合后,其酪氨酸激酶活性被激活,啟動了特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞向惡性表型轉(zhuǎn)化等生物學(xué)作用。在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中,IGF-1R的表達(dá)均顯著高于相應(yīng)的正常

3、組織。越來越多的證據(jù)表明:IGF-1R所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。
　　 我們應(yīng)用Western blot免疫印跡檢測Eca-9706、Eca-109和NEC三種食管鱗癌細(xì)胞株IGF-1R的表達(dá)情況,應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測食管鱗癌組織和正常食管上皮組織中IGF-1R的表達(dá),并分析其表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。
　　 siRNA技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種較新的分子生物學(xué)技術(shù)。其原理是將外源雙鏈RNA

4、與靶mRNA互補(bǔ)配對結(jié)合,切割并降解mRNA,降低靶蛋白的表達(dá),致使轉(zhuǎn)錄后基因沉默。siRNA技術(shù)具有高度的特異性、有效性和安全性,成為研究基因在腫瘤中的作用的良好工具。
　　 我們應(yīng)用siRNA技術(shù),將攜帶有IGF-1R特異性序列的真核表達(dá)載體pGCsilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞,觀察下調(diào)IGF-1R表達(dá)對食管癌細(xì)胞生長增殖能力、克隆形成能力、裸鼠體內(nèi)致瘤能力和對化療藥物敏感性的

5、影響,探討IGF-1R在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用,為食管癌靶向治療提供一個有效的靶點。
　　 IGFBP-3通過與IGF-1結(jié)合,阻止了其與受體IGF-1R的結(jié)合,從而抑制了IGF-1的生物學(xué)作用。而且,IGFBP-3還具有不依賴于IGF—1獨立的抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。人體循環(huán)中IGF-1水平增高將導(dǎo)致患多種惡性腫瘤的風(fēng)險增高,相反,循環(huán)中IGFBP-3水平升高將使患腫瘤的風(fēng)險降低。
　　 我們應(yīng)用酶聯(lián)免

6、疫吸附試驗檢測172例食管癌患者化療前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量。觀察化療前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量的變化,并將化療前IGF—1和IGFBP-3的含量與化療療效之間的關(guān)系進(jìn)行分析,為預(yù)測和評價化療療效提供一個參考指標(biāo)。
　　 本研究共分以下三個部分:
　　 第一部分 IGF-1R在食管鱗癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)
　　 方法：
　　 1.Western blot免疫印跡檢測食管癌E

7、ca-9706、Eca-109和NEC三種食管鱗癌細(xì)胞株IGF-1R蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.免疫組織化學(xué)檢測食管鱗癌組織和正常食管上皮IGF-1R的表達(dá)情況。
　　 3.分析食管癌組織中IGF-1R的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。
　　 4.統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù),分類變量之間的比較采用x2檢驗,以α=0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.三種食管癌細(xì)胞系中均有I

8、GF-1R蛋白的表達(dá),其中食管癌Eca-9706細(xì)胞表達(dá)水平較高,NEC細(xì)胞表達(dá)水平較低。
　　 2.經(jīng)免疫組化檢測,IGF-1R陽性部位位于細(xì)胞膜。80例食管鱗癌組織中11例為陰性,28例呈弱陽性,41例呈強(qiáng)陽性,總陽性率為86.25％,強(qiáng)陽性率為51.25％；18例正常組織中7例為陰性,9例為弱陽性,2例為強(qiáng)陽性,總陽性率為61.11％,強(qiáng)陽性率為11.11％。食管鱗癌組織中IGF-1R表達(dá)的總陽性率和強(qiáng)陽性率均高于正常食管

9、組織,有統(tǒng)計學(xué)意義(總陽性率x2=4.630,P<0.05；強(qiáng)陽性率x2=9.614,P<0.01)。
　　 3.不同年齡組和不同性別組IGF-1R的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
　　 4.有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者食管癌組織中IGF-1R表達(dá)的總陽性率和強(qiáng)陽性率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01)；不同分化程度的組織中IGF-1R表達(dá)情況為:低分化組>中等分化組>高分化組。三組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；臨床分期

10、較晚(Ⅲ-Ⅳ期)的患者食管癌組織中IGF-1R表達(dá)的總陽性率和強(qiáng)陽性率均高于臨床分期較早(Ⅰ—Ⅱ期)的患者(P<0.01)。
　　 第二部分下調(diào)IGF-1R表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 方法：
　　 1.將攜帶有IGF-1R特異性序列的真核表達(dá)載體pGCsilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R轉(zhuǎn)染食管癌Eca-9706細(xì)胞,空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。
　　 2.Weste

11、rn-blot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞IGF-1R蛋白和mRNA的表達(dá)情況。
　　 3.細(xì)胞計數(shù)法和MTT法檢測下調(diào)IGF-1R表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 4.MTT實驗檢測下調(diào)IGF-1R表達(dá)后,食管鱗癌Eca-9706細(xì)胞對化療藥物.5-Fu和順鉑的敏感性的改變。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)IGF-1R表達(dá)對食管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 6.平板克隆形成實驗檢測下調(diào)IGF-1R表達(dá)對

12、食管癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　 7.分別將未轉(zhuǎn)然細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的細(xì)胞接種裸鼠,觀察裸鼠成瘤情況。連續(xù)觀察5周后,處死裸鼠,稱取瘤重,計算抑瘤率。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)分析:應(yīng)用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以α=0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1.pGC

13、silencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,熒光倒置顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白。經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。
　　 2.pGCsilencerTMU6-IGF-1R轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞后,IGF-1R蛋白和mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和未轉(zhuǎn)然細(xì)胞明顯降低(P<0.05)。
　　 3.轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和未轉(zhuǎn)然細(xì)胞比較,增殖緩慢,倍

14、增時間延長。轉(zhuǎn)染pGCsilenceTMU6-IGF-1R的細(xì)胞培養(yǎng)48h后細(xì)胞生長抑制率為17.34％,高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞(抑制率2.66％)(P<0.01)。
　　 4.化療藥物5-Fu和順鉑對轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的食管癌細(xì)胞的抑制率高于對轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和未轉(zhuǎn)然細(xì)胞的抑制率(P<0.05)。
　　 5.轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較,

15、G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增高(P<0.05),S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低(P<0.01),細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05),克隆形成能力減弱(P<0.05)。
　　 6.接種轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6-IGF-1R細(xì)胞的裸鼠第10-11天可觀察到皮下小結(jié)節(jié),第14d、21d、28d和35d瘤體大小分別為57.1±19.1mm3、267.0±99.4mm3、482.3±274.9mm3和1006.4±579.8mm3；接種轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞的裸

16、鼠第10-11天可觀察到皮下小結(jié)節(jié),相應(yīng)時間點瘤體大小分別為61.5±24.2mm3、365.3±174.3mm3、632.9±306.7mm3和1799.3±658.1mm3；接種未轉(zhuǎn)然細(xì)胞的裸鼠第8-9天可觀察到皮下小結(jié)節(jié),相應(yīng)時間點瘤體大小分別為89.7±36.3mm3、446.4±240.7mm3、932.9±262.3mm3和2160.4±693.9mm3。三組裸鼠第28d和第35d的腫瘤體積大小之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<

17、0.05)。
　　 7.接種轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6i-IGF-1R細(xì)胞組裸鼠瘤重590.6±233.4mg；接種轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體細(xì)胞組裸鼠瘤重812.3±121.8mg；接種未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組裸鼠瘤重1236.8±152.5mg。接種轉(zhuǎn)染pGCsilencerTMU6i-IGF-1R細(xì)胞組裸鼠和接種空質(zhì)粒細(xì)胞組裸鼠的抑瘤率分別為52.25％和34.32％。三組裸鼠瘤重比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 第三部

18、分食管癌患者血清中IGF-1、IGFBP-3與化療療效的關(guān)系
　　 方法
　　 1.患者于第一周期化療前1～3天抽取靜脈血2ml,化療結(jié)束后(至少兩個周期)第二天抽取靜脈血2ml。抽取的靜脈血放置4h后,離心機(jī)2000轉(zhuǎn)／分,離心10分鐘,取上層血清于凍存管中,-40℃保存。
　　 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測患者化療前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量。
　　 3.觀察化療前后IGF-1

19、、IGFBP-3、IGF-1／IGFBP-3比值的變化,并分析其與化療療效的關(guān)系。
　　 4.根據(jù)化療前IGF-1和IGFBP-3的四分位值,將患者分為1-4四組,分析比較各組的化療有效率。
　　 5.統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。化療前后IGF-1、IGFBP-3和IGF-1／IGFBP-3比值的比較采用獨立樣本t檢驗。根據(jù)化療前IGF-1和IGFBP-3四分位值分組,各組間有效率的比較采用x2檢

20、驗。以α=0.05為檢驗顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1.患者總體化療前血清中IGF-1的含量為268.87±61.66ng／ml,化療后IGF-1的含量為266.42±49.98 ng／ml,兩者比較無明顯差異(P>0.05)。患者總體化療前血清IGFBP-3的含量為2523.2±469.83ng／ml,化療后IGFBP-3的含量為2598.8±563.56 ng／ml,兩者比較無明顯差異(P>0.05)。
　

21、　 2.IGF-1在化療有效組和無效組患者化療前后均無顯著性差異(P>0.05)；IGFBP-3在化療有效組患者化療后較化療前升高(P<0.01),無效組患者化療前后無顯著性差異(P>0.05)。IGF-1／IGFBP-3比值在化療有效組患者化療后下降,而化療無效組患者化療后升高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.根據(jù)IGF-1四分位值,由低到高分組,第1～4組有效率分別為34.09％、40.48％、67.44％、6

22、7.44％。血清中IGF-1水平越高的組,化療有效率也越高。第3、4兩組有效率相同,高于第2組和第1組,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.根據(jù)IGFBP-3四分位值,由低到高分組,第1～4組有效率分別為37.21％、46.51％、54.76％、73.81％。IGFBP-3水平越高的組,化療有效率也越高。第4組有效率高于其它三組,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.IGF-1R在食管鱗

23、癌Eca-9706細(xì)胞、Eca-109細(xì)胞和NEC細(xì)胞三種細(xì)胞系中均有不同程度的表達(dá)。
　　 2.食管鱗癌組織中IGF-1R的表達(dá)高于正常食管組織。
　　 3.IGF-1R的表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級和臨床分期有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者食管癌組織中IGF-1R的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；隨著組織分化程度的降低,IGF-1R的表達(dá)增高；臨床分期較晚的患者食管癌組織中IGF-1R的表達(dá)高于臨床分期較早

24、的患者。
　　 4.下調(diào)IGF-1R表達(dá)使食管鱗癌細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降,G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多,細(xì)胞凋亡增加。
　　 5.下調(diào)IGF-1R表達(dá)使食管鱗癌細(xì)胞生長增殖能力和克隆形成能力減弱,對化療藥物5-Fu和順鉑的敏感性增強(qiáng),細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力減弱,腫瘤生長緩慢。這些結(jié)果預(yù)示著IGF-1R在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
　　 6.化療前后血清中IGF-1／IGFBP-3比值能夠較好的反映食管癌患者的化療