硼替佐米對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力影響的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細(xì)胞克隆性增生的惡性腫瘤，是一種低增殖性、低凋亡活性的分子克隆疾病。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征。而腫瘤細(xì)胞的遷移是其侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。
　　 細(xì)胞遷移(cell migration)指的是細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動。在此過程中細(xì)胞不斷重復(fù)著向前方伸出突足，然后牽拉胞體向前移動。細(xì)胞骨架和其結(jié)合蛋白是這一過程的物質(zhì)基礎(chǔ)，另外還有多種物質(zhì)對之進行精密調(diào)

2、節(jié)。
　　 HSP90為生物進化過程中一種高度保守的胞漿蛋白質(zhì)。HSP90被抑制后可以抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成和移動；并且能抑制HGF/SFMET信號通路，使細(xì)胞的運動能力和侵襲能力減弱。已有研究證明，HSP90抑制劑可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞的調(diào)亡。HSP90有HSP90α和HSP90β兩種類型。HSP90α可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進細(xì)胞增殖，HSP90β能夠抑制細(xì)胞凋亡與分化。
　　 硼替佐米是治療復(fù)發(fā)或難治的MM的最有前途的新藥。

3、其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與很多事件有關(guān)，其中之一是激活經(jīng)典的應(yīng)激反應(yīng)蛋白如熱休克蛋白HSP27、HSP70、HSP90。眾多資料表明，在惡性腫瘤細(xì)胞中HSP90過度表達(dá)，并且以HSP90α的表達(dá)增高為主。本實驗以人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞為研究對象，探討了經(jīng)硼替佐米作用后的MM細(xì)胞中熱休克蛋白HSP90的表達(dá)情況，并通過Transwell小室趨化裝置觀測了藥物作用后的細(xì)胞遷移能力的變化，分析了HSP90與人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞遷

4、移能力的相關(guān)性。從而為進一步開發(fā)新藥及指導(dǎo)臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)凍存的MM細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，置于含10％的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO2和95％空氣濕度條件下進行培養(yǎng)，在細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時收集備用。
　　 2.侵襲實驗侵襲實驗用24孔趨化板，其孔徑為8μm。U266細(xì)胞在含10％的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中孵育，上室加U266細(xì)胞，下室分別加入

5、含有0，50，100，150，200 nmol/L濃度硼替佐米的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱37℃，孵育4h后收集下室懸液中的細(xì)胞，用細(xì)胞記數(shù)板在倒置顯微鏡下進行細(xì)胞記數(shù)。
　　 3.RT-PCR分別檢測經(jīng)硼替佐米作用和不經(jīng)其作用前后，體外MM細(xì)胞中HSP90α和HSP90β的表達(dá)水平。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料統(tǒng)計描述用x±s表示；多組資料之間的比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用S

6、NK法；HSP90α和HSP90β的表達(dá)與人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力的關(guān)系采用相關(guān)分析。所有分析結(jié)果均以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 通過上述研究方法，我們發(fā)現(xiàn)
　　 1.人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株中HSP90mRNA的表達(dá)情況
　　 隨著硼替佐米濃度的增加，其MM細(xì)胞中HSP90α的mRNA表達(dá)量逐漸增加。由低濃度組到高濃度組所對應(yīng)的HSP90α的灰度值分別為0.343±0.017、0.5

7、05±0.039、0.640±0.029、0.760±0.059、0.963±0.054；兩兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而HSP90β的灰度值0nmol/L(0.610±0.022)組與50、150、200nmol/L組之間有差別(P＜0.05)。50(0.765±0.050)、100nmol/L(0.645±0.052)濃度組對應(yīng)的HSP90β的灰度值不同(P＜0.05)。l00nmol/L組與150(0.770±0.

8、059)、200nmol/L(0.790±0.027)組對應(yīng)的HSP90β的灰度值有差別(P＜0.05)。雖然從圖上看HSP90β的mRNA表達(dá)量增加趨勢不很明顯，但總體上仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.硼替佐米對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力的影響
　　 U266細(xì)胞在趨化因子的作用下由上室遷移至下室，但因為下室中硼替佐米的藥物濃度不同，因此最終進入下室的細(xì)胞數(shù)不同。隨著藥物濃度的增加，進入下室的U266細(xì)胞

9、數(shù)分別為98.25±9.639、87.75±17.154、73.50±7.594、70.25±19.973、52.75±8.500。經(jīng)SNK法對各個不同濃度組所對應(yīng)的細(xì)胞遷移數(shù)進行兩兩比較，得出下述結(jié)果，0nmol/L組與100、150、200mol/L有差異(P＜0.05)；50nmol/L組與200nmol/L有差異(P＜0.05)。故隨著硼替佐米藥物濃度的增加，其U266細(xì)胞遷移數(shù)逐漸減少(P＜0.05)。
　　 3.HS

10、P90α和HSP90β表達(dá)與人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力的相關(guān)性分析。
　　 隨著硼替佐米藥物濃度的逐漸增加其細(xì)胞遷移能力呈下降趨勢，但其細(xì)胞內(nèi)的HSP90的表達(dá)呈逐漸上調(diào)趨勢，并且以HSP90α的增高為主。經(jīng)Pearson相關(guān)分析得知，HSP90的表達(dá)與人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移能力呈負(fù)相關(guān)(HSP90α的r值為-0.818，P＜0.05；HSP90β的r值為-0.591，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.隨