穿心蓮內(nèi)酯對(duì)慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)及抗乙肝病毒活性研究.pdf

1、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)持續(xù)感染所致,可發(fā)展為肝炎后肝硬化和肝癌。目前我國(guó)人群中乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性率仍高達(dá)7.18％,每年有幾十萬人死于與乙肝相關(guān)的重癥肝炎、肝硬化和肝癌,乙型肝炎病毒的慢性感染嚴(yán)重影響人民的身體健康。
　　慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,HBV特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte

2、CTL)功能下降是導(dǎo)致HBV持續(xù)性感染的主要原因。輔助性T細(xì)胞(helper T cell Th細(xì)胞)根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞,Th1細(xì)胞通過介導(dǎo)細(xì)胞免疫,清除胞內(nèi)病毒感染,Th2細(xì)胞通過輔助B細(xì)胞,促進(jìn)體液免疫,Th1細(xì)胞對(duì)維持CTL,功能起著重要作用。HBv感染后,如以Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),則有利于促進(jìn)HBV抗原特異性CTL增殖、活化,清除HBV感染;如以Th2細(xì)胞為主,CTL功能抑制不利于病毒清除。穿心蓮內(nèi)酯

3、(Andrographolide)為爵床科植物穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物,是中藥穿心蓮的主要有效成分之一,穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明,穿心蓮內(nèi)酯能誘導(dǎo)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生IFN-γ、IFN-a、TNF-a等,起到調(diào)節(jié)免疫作用,但對(duì)慢性乙型肝炎患者的免疫調(diào)節(jié)作用及是否對(duì)乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)具有抑制作用了解甚少,至今尚未見相關(guān)報(bào)道。
　

4、　本研究共有二部分內(nèi)容。
　　第一部分:分離CHB患者PBMC后給予穿心蓮內(nèi)酯刺激,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)CHB患者PBMC內(nèi)IFN-γmRNA、IL-4mRNA、IL-10mRNA及TNF-amRNA表達(dá)變化,了解穿心蓮內(nèi)酯對(duì)CHB患者免疫調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分:不同濃度穿心蓮內(nèi)酯刺激HepG2.2.15細(xì)胞后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR.方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制水平,了解穿心蓮內(nèi)酯體外抗HBV的活性。

5、　　第一部分穿心蓮內(nèi)酯對(duì)慢性乙型肝炎患者PBMc表達(dá)Th1及Th2細(xì)胞因子的影響
　　目的：探討穿心蓮內(nèi)酯對(duì)體外培養(yǎng)慢性乙型肝炎患者PBMC表達(dá)Th1細(xì)胞因子IFN-γmRNA及Th2細(xì)胞因子IL-4mRNA和IL-10mRNA影響。
　　方法：采集健康人及慢性乙型肝炎患者靜脈血后分離PBMC,細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至4×106/mL,接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中,行細(xì)胞毒性試驗(yàn)、時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)及藥物劑量試驗(yàn)。根據(jù)上述結(jié)果,實(shí)驗(yàn)組用穿心蓮內(nèi)

6、酯10mg/L(0.1％二甲基亞砜稀釋),對(duì)照組用0.1％二甲基亞砜加入細(xì)胞培養(yǎng)液中刺激慢性乙型肝炎患者PBMC,置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)后收取細(xì)胞。抽提RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IFN-γmRNA、IL-4mRNA及IL-10mRNA表達(dá)水平,比較慢性乙型肝炎與健康對(duì)照組的PBMC各細(xì)胞因子表達(dá)差異,比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各細(xì)胞因子的表達(dá)水平是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。
　

7、　結(jié)果：慢性乙型肝炎患者PBMC的IL-4mRNA表達(dá)水平高于健康人,而IFN-γmRNA、IL-10mRNA的表達(dá)水平無明顯差異。慢性乙型肝炎患者PBMC經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯10mg/L(實(shí)驗(yàn)組)及O.1％二甲基亞砜(對(duì)照組)處理16小時(shí)后,實(shí)驗(yàn)組PBMC的IFN-γmRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組PBMC的IFN-γmRNA表達(dá)水平,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.78,P=0.005),實(shí)驗(yàn)組PBMC的IL-4mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)水平明顯

8、低于對(duì)照組PBMC的IL-4mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)水平,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-3.82,P＜0.001)。PBMC表達(dá)IFN-γmRNA與IL-4mRNA的比例(IFN-γmRNA/IL-4mRNA),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯提高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-3.82,P＜0.001)。
　　結(jié)論：穿心蓮內(nèi)酯對(duì)體外培養(yǎng)慢性乙型肝炎患者的PBMC表達(dá)Th1細(xì)胞因子IFN-γmRNA及Th2細(xì)胞因子IL-4mRNA和IL-10mRNA均有

9、調(diào)節(jié)作用,并能改善Th1/Th2平衡。
　　第二部分穿心蓮內(nèi)酯體外抗乙型肝炎病毒活性的研究
　　目的：通過檢測(cè)經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯處理后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBVDNA復(fù)制水平,探討其體外抗乙型肝炎病毒的活性。
　　方法：復(fù)蘇HepG2.2.15細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),將細(xì)胞按每孔5×105/mL接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組分別予0mg/L、5mg/L、10mg/L,穿心蓮內(nèi)酯共培養(yǎng)7天,對(duì)照組分別予0umol/

10、L、25umol/L、50umol/L,阿德福韋共培養(yǎng)7天,每濃度2復(fù)孔,隔日換含相同濃度藥物的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)結(jié)束后觀察細(xì)胞形態(tài)。抽提HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)病毒核心顆粒HBVDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用不同濃度藥物刺激后細(xì)胞內(nèi)HBVDNA水平,比較同一組間不同濃度藥物刺激后HBVDNA水平是否有差異。本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：經(jīng)0mg/L、5mg/L、10