ISG20參與調(diào)節(jié)α-干擾素抗乙肝病毒活性的機制研究.pdf

1、目的：
　　干擾素刺激基因20（ISG20）是一種由I型（IFNα/β）或II型干擾素（IFN-γ）誘導產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有特異的單鏈RNA或DNA的核酸外切酶活性，對于多種RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用。細胞內(nèi)定位分析發(fā)現(xiàn)ISG20主要位于核小體和Cajal小體，鑒于核小體是rRNA和核糖體生成的主要場所，Cajal小體是snRNA和snoRNA生成的主要場所，進一步提示 ISG20可能通過其核酸外切酶作用影響snRNA和

2、rRNA的成熟，從而抑制蛋白合成進而發(fā)揮抗病毒作用。因此，ISG20的表達差異及核酸外切酶活性對于不同病毒感染性疾病的發(fā)病、α-干擾素治療的療效及預后可能具有重要影響。本研究從臨床試驗和體外實驗兩方面觀察ISG20在α-干擾素治療應答組及無應答組慢乙肝患者肝臟組織標本中的表達差異與α-干擾素療效的相關性，并對其所參與的α-干擾素抗乙肝病毒機制進行初步研究。
　　方法：
　　本研究首先選取接受α-干擾素治療的慢乙肝患者24人，

3、給予聚乙二醇干擾素α-2a（Peginterferon-alpha-2a，派羅欣）抗乙肝病毒治療48周，共隨訪72周，依隨訪結果分為治療應答組及無應答組。對其治療前肝穿標本行免疫組化檢測觀察ISG20蛋白在各組肝臟組織中的差異表達并以QRT-PCR加以驗證。在體外實驗中，我們選擇在HBV-DNA全基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2形成的HepG2.2.15細胞系上進行研究，后者是體外研究乙肝病毒對肝細胞影響的經(jīng)典模型。通過構建ISG2

4、0過表達慢病毒載體感染HepG2.2.15細胞，觀察ISG20差異表達對乙肝病毒活性的影響，驗證ISG20的抗乙肝病毒作用;通過點突變方法構建 ISG20去核酸外切酶活性的慢病毒載體，探討 ISG20發(fā)揮抗乙肝病毒作用的機制是否依賴外切酶活性。分別用QRT-PCR及化學發(fā)光法檢測細胞上清液中HBV-DNA及乙肝表面抗原(HBsAg)及e抗原（HBeAg）評價其抗乙肝病毒活性。
　　結果：
　　免疫組化染色結果顯示α-干擾素治

5、療應答組患者治療前肝組織中ISG20蛋白較無應答組及對照組顯著升高,且在應答組ISG20主要表現(xiàn)為細胞核高表達，明顯區(qū)別于無應答組及對照組。在體外實驗中，加入α-干擾素處理后，ISG20隨著α-干擾素濃度的增加逐漸升高。野生型ISG20過表達組可以顯著抑制乙肝病毒，這一結果與α-干擾素干預組的結果相似，并且ISG20過表達慢病毒與α-干擾素聯(lián)合干預HepG2.2.15細胞后,其抑制乙肝病毒作用顯著增強；而突變型ISG20的外切酶活性失活

6、后，ISG20對乙肝病毒的抑制作用消失。此外，行免疫熒光檢測，可見ISG20蛋白高表達于細胞核，這一結果與肝活檢的免疫組化染色結果相一致，進一步證實ISG20抗乙肝病毒作用主要依賴于其核酸外切酶活性。
　　結論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)在α-干擾素治療慢乙肝應答組及無應答組中，ISG20蛋白的表達水平及細胞內(nèi)分布存在顯著差異，提示肝組織內(nèi)ISG20蛋白的差異表達與α-干擾素治療慢乙肝的療效相關。體外實驗證實，ISG20作為干擾素刺激