抗雄激素物質氟他胺作用于受孕SD大鼠引起尿道下裂的機制研究.pdf

1、尿道下裂是小兒泌尿外科常見畸形之一，主要見于男性。據(jù)國外統(tǒng)計，活產嬰兒中發(fā)病率近1／250-1／300，我國發(fā)病率約為2-3／1000。近三十年來，此病發(fā)病率有明顯增加的趨勢，幾乎增加了一倍，這顯然是用遺傳因素所不能解釋的，當然不能排除監(jiān)測或報告系統(tǒng)逐漸完善外，但病例的增加之迅速應當另有原因。 目前，很多泌尿生殖的領域的學者已把注意力放在外界環(huán)境中，一些學者認為環(huán)境中廣泛存在的環(huán)境內分泌干擾污染物可能是造成尿道下裂發(fā)病率上升的

2、原因。但環(huán)境污染物作用于人，引發(fā)尿道下裂的發(fā)病的生物效應機制并不十分清楚，有研究者推測，環(huán)境污染物可能是通過迫使機體正常內分泌因素改變而發(fā)生下裂畸形，因為人們經常攝入或接觸有抗雄激素的活性的外源性物質如殺蟲劑、塑料制品的副產品、藥物等等，導致其出生的后代出現(xiàn)尿道下裂發(fā)生。從某種程度上看，環(huán)境內分泌干擾物更可能解釋全球范圍內尿道下裂發(fā)生和發(fā)病率升高的某些原因。 已有的研究表明，環(huán)境中具有抗雄激素活性的物質能與雄激素受體(andro

3、gen receptor；AR)相互作用，與雄激素競爭AR，主要是AR拮抗劑，被稱為環(huán)境抗雄激素。眾所周知，雄激素在雄性顯型表達中起著關鍵的作用，以及AR在性分化和發(fā)育過程介導雄激素作用的重要性，環(huán)境抗雄激素暴露更有可能對雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育產生不良影響，因此環(huán)境抗雄激素的研究受到了廣泛的關注。自上世紀九十年代以來，有關環(huán)境抗雄激素物質干擾健康效應的報導逐漸增多，研究資料顯示，抗雄激素物質能夠引起魚類及多種野生生物的生殖功能下降，動物實驗研

4、究結果表明，抗雄激素物質能改變體內的性激素平衡，損傷雄性動物的生殖功能，但有關抗雄激素物質對生殖發(fā)育毒性的研究報導相對較少，且結論缺乏一致性；同時對其生殖系統(tǒng)早期發(fā)育的干擾及分子機理的研究也缺乏系統(tǒng)性。因此，我們選擇了抗雄激素物質氟他胺(flutamide,Flu)作為研究對象，建立尿道下裂動物模型，以及觀察出生后雄性子代的性分化和性發(fā)育情況，并采用組織病理學技術、免疫組織化學技術、電鏡技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗、實時熒光定量的RT-PCR

5、技術及基因芯片技術，探討Flu作用于受孕SD大鼠引起尿道下裂的分子機理，為臨床尿道下裂的防治提供理論和試驗依據(jù)。 第一部分 氟他胺建立SD大鼠尿道下裂動物模型的實驗研究 從孕12-17d連續(xù)6d每天8：00腹部皮下分別注射用生理鹽水配制的Flu O、4492.2、4882.8、5273.4、5664.0、6054.6 μ g/kg。于孕18d每組解剖兩只孕鼠，提取子代雄性胎鼠尿生殖結節(jié)做病理切片，同時觀察睪丸位置和前列

6、腺發(fā)育情況。并于出生后第2、13、28d觀察雄性仔鼠性分化與性發(fā)育的指標。實驗結果：Flu染毒組雄性子一代肛殖距各組均明顯小于對照組，尿道下裂的發(fā)生率依次為0、29.00％、63.68％、93.02％、100％；單側隱睪發(fā)生率分別為0、4.55％、8.70％、13.95％、15.56％；乳暈延遲退化率均為100％；各組前列腺不發(fā)育或發(fā)育不全。不同時間段各用藥組與AGD做直線相關分析，其相關系數(shù)r分別為-0.6933，-0.7172，-0

7、.7480，經t檢驗P值均小于0.01。結果說明，在一定的劑量范圍內，隨著染毒劑量的增加，大鼠的性分化和性發(fā)育異常亦隨之有增加的趨勢，尤其是肛殖距與染毒劑量之間呈現(xiàn)高度的負相關。且針對畸形指標尿道下裂而言，F(xiàn)lu最大無作用劑量為4492.2 μ g／kg。 第二部分 氟他胺引起SD大鼠尿道下裂機制的實驗研究 對F0親代母鼠從孕12-17d皮下注射Flu(6054.6 μ g／kg)染毒，于雄性子代出生后第2d檢測睪酮激

8、素水平；在胚胎20d解剖孕鼠，提取雄性胎鼠尿生殖結節(jié)做病理切片和免疫組織化學制片；同時提取雄性胎鼠睪丸做電鏡觀察、免疫組織化學及實時熒光定量的RT-PCR實驗。實驗結果：Flu染毒組雄性子代出生后第2d睪酮激素水平降低。胚胎期病理切片顯示尿道下裂的形成。電鏡觀察睪丸間質細胞粗面內質網(wǎng)擴張，線粒體腫脹。免疫組織化學結果提示：在生殖結節(jié)、間充質細胞、尿道細胞中EGF、EGFR、PCNA蛋白表達不足，Caspase-3蛋白表達增強，AR蛋白表

9、達與對照組相同。在睪丸間質細胞中P450scc、3B-HSD、PCNA蛋白表達降低，AR蛋白表達與對照組相同。實時熒光定量的RT-PCR實驗顯示：在睪丸間質細胞中P450scc、3B-HSD、P450c17基因表達降低，17B-HSD、PCNA基因表達減弱，AR基因表達與對照組相同。實驗結果提示Flu引起尿道下裂的發(fā)生，并不是通過改變受體水平而實現(xiàn)的，其可能的機制為：1、Flu通過抑制睪丸間質細胞中合成睪酮代謝酶的活性，降低睪酮激素水平

10、，導致尿道下裂的發(fā)生；2、Flu通過與雄激素競爭結合AR，阻止AR-DNA結合和雄激素依賴基因轉錄而導致尿道下裂的發(fā)生。 第三部分 氟他胺對胚胎期SD大鼠睪丸發(fā)育整體基因表達水平影響的研究 對FO親代母鼠從孕12-17d皮下注射Flu(6250.0ug／kg)染毒，于胚胎20d解剖孕鼠，取出實驗組與對照組雄性胎鼠睪丸，提取mRNA，分別用cy5(實驗組)和cy3(對照組)探針逆轉錄標記，與Rat12KcDNA(12000

11、位點基因芯片)表達譜芯片雜交，熒光掃描分析，篩選Cy5／Cy3比值大于2.0或小于0.5的差異表達基因。結果：①類固醇激素代謝調控相關基因表達，睪丸間質細胞睪酮合成關鍵酶——細胞色素P450側鏈裂解酶(cholesterol side-chaincleavage enzyme，P450scc)和17β-羥基脫氫酶(hydroxysteroid(17-beta)dehydro~enase 10，Hsdl7b10)下調，降低睪酮激素的代謝水

12、平。②參與合成代謝相關基因表達，核糖體蛋白S9(Ribosomal protein S9,Rps9)下調，使睪丸組織細胞蛋白質合成不足。③對細胞凋亡的相關基因表達，YYl(YYltranscriotion factor)、Rac2(RAS-related C3 botulinum substrate 2)基因下調，說明此期睪丸組織凋亡增強。④對免疫調控相關基因表達，EB病毒誘導基因3(Epstein-Barr virus induced

13、 gene 3，Ebi3)、溶菌酶基因(1ysozyme gene)與溶菌酶外顯子1-4亞型基因(1ysozyme gene eXOllS 1-4)下調，使睪丸細胞降低了對病原菌的抵抗力和免疫能力。⑤對氧化代謝相關的基因表達，已糖激酶3(Hexokinase 3，Hk3)上調和完整線粒體基因組(completemitochondrial genome)上調，提示可能是由于有氧代謝的ATP供能不足，促使糖孝解增強以滿足合成代謝供能。⑥對信

14、號傳遞及信號通道相關基因表達，similar tO calsyntenin 1基因和Laspl(LIM and SH3 protein 1)基因下調，前者可以調節(jié)Ca<'2+>介導多種信號傳遞途徑；后者可以通過Ras蛋白的信號傳遞途徑調節(jié)酪氨酸激酶介導的信號系統(tǒng)活性。 從以上的結果可見，F(xiàn)lu能夠引起睪丸性激素合成下降，并能使睪丸合成代謝、氧化代謝、免疫調節(jié)及信號通道的相關基因表達下調或上調，且凋亡增強，這些說明了Flu對睪丸的