RNA干擾技術(shù)沉默iNOS基因?qū)m頸癌細(xì)胞株增殖活性及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升、發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢(shì)。晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌的預(yù)后很差，其臨床治療多采用手術(shù)、化療或放療等綜合性治療，雖然能夠取得一定的臨床療效，但由于病灶容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，最終的治療效果仍不理想，且伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，尋找新的治療方法勢(shì)在必行。
　　新生血管是腫瘤賴以生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。腫瘤組織必須依賴血管提供營(yíng)養(yǎng)，才能維持其生長(zhǎng)，并實(shí)現(xiàn)瘤灶的血行性播散。
　　一氧化氮(nitric oxid

2、e，NO)是促進(jìn)腫瘤血管形成的細(xì)胞因子，iNOS作為NO合成的關(guān)鍵酶，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，催化合成大量的NO，促進(jìn)腫瘤血管的形成，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。既往的研究均表明iNOS的表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。同樣，在宮頸癌組織中，iNOS的高表達(dá)與惡性程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) VEGF是已知的、腫瘤新生血管形成最重要、作

3、用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，iNOS通過NO介導(dǎo)，在誘導(dǎo)VEGF促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成過程中發(fā)揮作用。
　　RNA干擾(RNA interfcrence，RNAi)是一種新近發(fā)展起來的基因沉默技術(shù)，由雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)，導(dǎo)致同源mRNA降解，從而阻止目的基因的表達(dá)。慢病毒作為一種介導(dǎo)siRNA或shRNA的較理想的載體，目前在干擾技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。
　　據(jù)此，采用RNA干擾技術(shù)抑制iNOS目的基因的表達(dá)，降低NO的合成，進(jìn)

4、而下調(diào)VEGF水平，抑制腫瘤血管生成，為中晚期宮頸癌的治療模式提供新的思路和理論依據(jù)。
　　本課題分為三大部分:
　　1、iNOS基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建;
　　2、iNOS—shRNA感染宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa的體外研究;
　　3、iNOS—shRNA對(duì)宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞株生長(zhǎng)影響的體內(nèi)研究。
　　第一部分:iNOS基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及感染富頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞株

5、r>　　[目的]體外構(gòu)建iNOS基因RNAi慢病毒載體，感染宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞株。
　　[方法]根據(jù)iNOS基因序列設(shè)計(jì)三條iNOS-shRNA，分別構(gòu)建3個(gè)shRNA慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并通過PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定正確后分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝，繼而感染宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞株，后采用Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。并采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一

6、步驗(yàn)證干擾結(jié)果。
　　[結(jié)果]PCR和測(cè)序證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。感染宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞后，鑒定出目的細(xì)胞的iNOS基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均明顯下降。
　　[結(jié)論]構(gòu)建的iNOS-shRNA慢病毒載體，感染宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa后，iNOS基因無論在mRNA水平還是在蛋白水平，其表達(dá)均明顯下降，從而證實(shí)了此表達(dá)載體的干擾效果。
　　第二部分慢病毒載體iNOS—shRNA感染宮頸癌細(xì)胞株的體外研究

7、
　　[目的]觀察iNOS—shRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa生長(zhǎng)的影響，并在干擾后加入外源性不同濃度NO供體，探討iNOS，NO與VEGF的相關(guān)性。
　　[方法]將宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa分為三組，第一組感染iNOS—shRNA（干擾組），第二組感染隨機(jī)序列（陰性對(duì)照組），第三組未做處理（空白對(duì)照組）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Griess法檢測(cè)細(xì)胞

8、上清的NO含量，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液VEGF的水平，Real-timePCR和Western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞iNOS，VEGFmRNA和蛋白表達(dá)水平。陰性對(duì)照組和干擾組分別加入不同濃度NO供體-硝普鈉(SNP)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液VEGF的水平， Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)iNOS，VEGFmRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　[結(jié)果]干擾組增殖速率降低，凋亡率增加，與陰性對(duì)照組和空白

9、對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干擾組細(xì)胞上清液NO和VEGF的水平明顯降低，iNOS，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，與其他兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陰性對(duì)照組和干擾組分別加入不同濃度SNP，SNP在0-0.5mmol/L的濃度范圍，細(xì)胞上清液VEGF，VEGFmRNA和蛋白水平漸進(jìn)性增加，且在SNP濃度為0.5mmol/L時(shí)達(dá)到峰值，SNP濃度繼續(xù)增至1.0mmol/L時(shí)，細(xì)胞上清液VEGF和VEGFmRNA和蛋白水平均

10、回落。加入不同濃度SNP，iNOS的mRNA和蛋白水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)論]iNOS基因干擾后，宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞分泌NO和VEGF減少;iNOS和VEGF密切相關(guān)，iNOS對(duì)VEGF的作用是通過NO介導(dǎo)的。加入外源性NO后，在較低濃度范圍，能調(diào)節(jié)VEGF水平。
　　第三部分 iNOS—shRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞株(SiHa和HeLa)生長(zhǎng)影響的體內(nèi)研究
　　[目的]探討iNOS被

11、干擾后對(duì)人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響以及iNOS、VEGF表達(dá)變化的關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證前期試驗(yàn)的結(jié)果。
　　[方法]體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa細(xì)胞，然后制成細(xì)胞懸液，注射于裸鼠前腋?jìng)?cè)皮下，觀察腫瘤形成，大小和重量變化。至移植腫瘤25天后犧牲裸鼠，取腫瘤組織做病理切片，用免疫組化法測(cè)各組腫瘤iNOS和VEGF的表達(dá)。
　　[結(jié)果]裸鼠皮下形成移植瘤，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大。而干擾組腫瘤體積和重量小于對(duì)照組;其腫瘤組